Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Соединительная ткань. Современные представления о репаративной регенерации 11
1.2. Особенности репаративного процесса при антиглаукомной фистулизирующей операции 21
1.3. Биорезорбируемые матриксы на основе коллагена 24
1.4. Применение матриксов на основе коллагена в дренажной хирургии глаукомы 26
1.5. Заключение 30
Глава 2. Материалы и методы исследования 33
2.1 Материалы и методы экспериментальной части исследования 33
2.1.1 Исследование биосовместимости и цитотоксичности матриксов на основе коллагена in vitro 33
2.1.2 Исследование биосовместимости и биодеградации матриксов на основе коллагена in vivo 34
2.2 Материалы и методы клинической части исследования 44
2.3 Методы статистической обработки материала 52
Глава 3. Результаты экспериментального исследования 53
3.1 Исследование биосовместимости и цитотоксичности матриксов на основе коллагена in vitro . 53
3.2 Морфологическое исследование переднего отрезка глаза кролика 56
3.3 Изучение регенеративного потенциала биорезорбируемого коллагенового матрикса (гемостатической губки) на модели полнослойного дефекта конъюнктивы глаза кролика 57
3.4 Изучение биосовместимости и биодеградации матрикса на основе коллагена (гемостатической губки и дренажа iGen) при одномоментном субконъюнктивальном и интрасклеральном введении 72
Глава 4. Результаты клинического исследования 82
4.1 Биорезорбируемый антиглаукомный дренаж оригинальной конструкции 82
4.2 Метод транслимбального микродренирования передней камеры с имплантацией биорезорбируемого антиглаукомного дренажа 83
4.4 Частота гипотензивного успеха операции 88
4.5 Частота и характер осложнений 88
4.6 Динамика функциональных показателей 89
Заключение 93
Выводы 100
Практические рекомендации 101
Список литературы 102
- Соединительная ткань. Современные представления о репаративной регенерации
- Исследование биосовместимости и цитотоксичности матриксов на основе коллагена in vitro
- Изучение биосовместимости и биодеградации матрикса на основе коллагена (гемостатической губки и дренажа iGen) при одномоментном субконъюнктивальном и интрасклеральном введении
- Динамика функциональных показателей
Соединительная ткань. Современные представления о репаративной регенерации
Соединительная ткань входит в состав всех органов. К ее основным функциям относят биомеханическую (опорную), метаболическую, защитную, структурообразовательную и репаративную. Соединительная ткань поддерживает гомеостаз, участвуя в процессах заживления ран, воспаления и фиброза [33]. Выделяют два основных типа соединительной ткани: рыхлую неоформленную (строма паренхиматозных органов, фасции мышц, подкожная жировая клетчатка) и плотную оформленную (сухожилия, связки, плотные фасции и апоневрозы, костная и хрящевая ткань, клапаны сердца, кровеносные сосуды, дерма). К специальным видам соединительной ткани относят кровь, конъюнктиву, склеру, стекловидное тело, синовиальные и серозные оболочки, подслизистый слой полых органов, дентин, пульпу и эмаль зуба. В условиях патологии формируются другие виды соединительной ткани: грануляционная и рубцовая ткань, фиброзная ткань при склерозе и циррозе паренхиматозных органов, а также отложения гиалина и амилоида, формирование костной мозоли [31, 33, 35].
Соединительная ткань представлена клеточным, межклеточным и сосудистым компонентами. Особенностью данной ткани является преобладание экстрацеллюлярного матрикса (ЭЦМ) над клеточными элементами. К основным типам клеточных элементов относят фибробласты (и их разновидности, характерные для отдельных видов соединительной ткани – кератобласты, остеобласты, хондробласты и т.п.), макрофаги и тучные клетки (лаброциты). Лимфоциты, гранулоциты и плазмоциты, обнаруживающиеся в соединительной ткани, проникают в нее гематогенным путем при патологических процессах. ЭЦМ представлен коллагеновыми и эластиновыми волокнами, пространство между которыми заполнено основным веществом, содержащим углеводно-белковые комплексы (протеогликаны и гликопротеины) [33, 35].
Репаративная регенерация соединительной ткани направлена на обновление структурных элементов и восстановление их количества для сохранения необходимого уровня функциональной активности. Реституция – исход репаративной регенерации, при котором происходит полное восстановление исходной структуры органа. Субституция – это результат репарации, заключающийся в восполнении дефекта неспецифической соединительной тканью и формированием рубца. Как правило, репаративная регенерация ткани зависит от пролиферативного потенциала клеток и объема повреждения. Лабильные клетки обладают высокой пролиферативной активностью и характерны для ткани с интенсивным апоптозом клеток в физиологических условиях (лимфоидная и эпителиальная ткань, костный мозг). Стабильные клетки являются клетками среднего пролиферативного потенциала и регенерируют только при повреждении ткани (гепатоциты). Перманентные клетки (нейроны, кардиомиоциты) практически не способны к делению.
Таким образом, в тканях, образованных лабильными клетками возможна репаративная регенерация путем реституции. Повреждение ткани, представленной стабильными клетками, сопровождается субституцией, однако при определенных условиях возможно формирование участков полного восстановления структуры и целостности ткани (реституция). Повреждение кардиомиоцитов и нейронов приводит к образованию фиброзного или глиального рубца при субституции [31, 81].
Фазы заживления хирургической раны.
Заживление хирургической раны является непрерывным, динамическим процессом, в котором участвуют местные и мигрирующие популяции клеток, медиаторы воспаления и факторы роста (таблица 1). Выделяют четыре взаимосвязанных этапа заживления: коагуляция и гемостаз, острое воспаление, пролиферация и ремоделирование новообразованной соединительной ткани [18, 31, 33, 35, 53]. Фаза коагуляции и гемостаза.
Сразу после повреждения наступает кратковременная вазоконстрикция и резкое уменьшение скорости кровотока. Это обусловлено возбуждением симпатических волокон и усиленным высвобождением норадреналина, а также выбросом серотонина. В результате вазоконстрикции возникает локальная ишемия, сопровождающаяся резким снижением доставки кислорода и других субстратов и, как следствие, ослаблением тканевого дыхания, активацией анаэробного гликолиза и развитием ацидоза. Помимо этого, резкое сужение сосудов в ответ на повреждение приводит к ограничению притока и оттока крови, а значит – изолирует очаг воспаления и препятствует распространению повреждающего агента [21, 31, 33, 35]. На фоне возникшего локального ацидоза происходит пассивное расслабление гладкомышечных волокон и возобновление кровотечения [119].
Повреждение эндотелиальных клеток микрососудов запускает процесс формирования кровяного сгустка, направленный на остановку кровотечения. Другими факторами тромбообразования считают изменение клеточного состава крови, ее реологических свойств, активацию свертывающей и угнетение противосвертывающей систем, накопление медиаторов, а также замедление скорости и нарушение ламинарности кровотока. В патогенезе формирования тромба выделяют два взаимосвязанных механизма: сосудисто-тромбоцитарный (клеточный) и коагуляционный (плазменный). Индукторами активации тромбоцитов являются высокие концентрации АДФ в эндотелиоцитах, а также определяющиеся в плазме крови медиаторы симпатической нервной системы, серотонин, «обнаженный» коллаген субэндотелиальной мембраны, тромбин, фактор Виллебрандта, тромбоцитактивирующий фактор. В течение 1-5 сек. происходит активация и адгезия тромбоцитов к поврежденной сосудистой стенке. Коагуляционная фаза гемостаза заключается в образовании активного тромбопластина, протеолитические свойства которого способствуют переходу протромбина в тромбин, в свою очередь, обеспечивающий трансформацию фибриногена в фибрин. В результате полимеризации фибрина, ретракции и уплотнения тромбоцитарно-фибринной массы формируется кровяной сгусток (тромб). Он состоит из коллагеновых волокон, тромбоцитов, тромбина и фибронектина и представляет собой матрикс для миграции нейтрофилов, моноцитов, фибробластов и эндотелиальных клеток [63, 82]. Кроме того, -гранулы тромбоцитов содержат тромбоцитарный фактор роста (platelet-derived growth factor - PDGF), трансформирующий фактор роста (transforming growth factor - TGF-), эпидермальный фактор роста (epidermal growth factor - EGF), фактор роста фибробластов (fibroblast growth factor - FGF), -тромбоглобулин, тромбоцитарный фактор 4 (platelet factor 4 - PF4), компоненты системы комплемента, гистамин, серотонин, брадикинин и простагландины (PGI2 -простациклин, тромбоксан А2). Все эти соединения при высвобождении регулируют процессы воспаления и регенерации ткани, изменяя диаметр просвета сосудов и проницаемость их стенок и способствуя активации и миграции в очаг повреждения нейтрофилов, моноцитов и макрофагов, эндотелиальных клеток и фибробластов [84, 105, 127]. Фаза воспаления
На этапе раннего воспаления, сразу после достижения гемостаза, под влиянием гистамина, кининов (брадикинина и каллидина), фибринопептидов, С-2 и С-3 компонентов системы комплемента, простациклина и лейкотриенов LTС4, LTD4, LTE4 возникает вазодилатация, повышается проницаемость сосудистой стенки и усиливается экссудация [3].
Нейтрофилы, первые клетки-мигранты, оказываются в очаге через несколько минут после повреждения, привлекаемые хемоаттрактантами, секретируемыми тромбоцитами (TGF-, PF4, С3а и С5а компонентами системы комплемента) и бактериальными N-формилметионилпептидами [39, 105, 127]. Процесс миграции разделяют на краевое стояние нейтрофилов (маргинацию), их прохождение через сосудистую стенку (диапедез) и движение в ткани. Данные механизмы реализуются при помощи хемокинов и других медиаторов, обладающих хемотаксической активностью в отношении нейтрофилов и эндотелиальных клеток. Нейтрофилы осуществляют первичный фагоцитоз поврежденных клеток и бактериальных агентов, разрушая их при помощи протеолитических ферментов (эластазы и металлопротеиназы) и свободных радикалов кислорода. Они занимают доминирующее положение в очаге воспаления в течение 6-24 ч, постепенно подвергаясь апоптозу. Остатки клеток и апоптотические тела элиминируются моноцитами [31, 71].
Накопление моноцитов в очаге воспаления стимулируют такие хемоаттрактанты, как TGF-, PDGF, компоненты системы комплемента, PF4, LTB4, а также продукты распада коллагена и эластина [100]. Их максимальный уровень достигается в течение 24-48 ч. Под влиянием интерлейкина 2 (interleukin-2, IL-2), фактора некроза опухоли (tumor necrosis factor , TNF-), PDGF, интерферона (interferon , IFN-) моноциты постепенно трансформируются в макрофаги.
Исследование биосовместимости и цитотоксичности матриксов на основе коллагена in vitro
При световой микроскопии, выполненной сразу после нанесения суспензии клеток на поверхность гемостатической губки и дренажа iGen, визуализируется ячеистая структура матриксов и единичные округлые клетки, попавшие в поры (ячейки). Необходимо отметить, что гемостатическая губка имеет более упорядоченное расположение волокон, формирующих поры большего размера в сравнении с дренажом iGen (рисунок 4).
Через 1 сутки культивирования определяются единичные фибробласты в глубоких слоях гемостатической губки и дренажа iGen. Клетки имеют характерное веретеновидное строение, распластываются по поверхности матрикса и стремятся к адгезии к коллагеновым волокнам (рисунок 5). Рисунок 5. Микроскопическая картина заселения матрикса через 1 сутки культивирования. А. Гемостатическая губка. Б. Дренаж iGen; клетки (). Съемка в режиме детекции флуоресценции, наложение двух каналов. Коллагеновый матрикс аутофлуоресцирует голубым цветом, цитоплазма живых клеток окрашена в зеленый цвет (Calcein), ядра – в синий цвет (Hoechst).
К 7 суткам культивирования отмечается значительное увеличение количества фибробластов, формирующих сетчатую структуру, выстилающую внутреннюю и наружную поверхности матриксов. Клетки имеют вытянутую веретеновидную форму и овальное ядро. Во многих клетках можно отметить наличие двух ядер – признак продолжающегося процесса митоза (рисунок 6). Необходимо отметить, что на данном сроке на поверхности обоих типов коллагеновых матриксов (гемостатической губки и дренажа iGen) практически отсутствуют погибшие клетки. л:/
Микроскопическая картина заселения матрикса через 7 суток культивирования. А. Гемостатическая губка. Б. Дренаж iGen; клетки (). Съемка в режиме детекции флуоресценции, наложение двух каналов. Коллагеновый матрикс аутофлуоресцирует голубым цветом, цитоплазма живых клеток окрашена в зеленый цвет (Calcein), ядра – в синий цвет (Hoechst).
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о высокой биосовместимости и низкой цитотоксичности гемостатической губки и дренажа iGen. Поверхность данных матриксов служит основой для адгезии и пролиферации фибробластов. Распределение клеток является равномерным и не отличается между разными типами матриксов.
Изучение биосовместимости и биодеградации матрикса на основе коллагена (гемостатической губки и дренажа iGen) при одномоментном субконъюнктивальном и интрасклеральном введении
У кроликов II группы на 7 сутки после операции при морфологическом исследовании полутонких срезов структур переднего отрезка глаза гемостатическая коллагеновая губка заполняет склеральный канал и субконъюнктивальное пространство (рисунок 27). Выраженная локальная воспалительная реакция сопровождается макрофагальной, лимфоцитарной и лейкоцитарной инфильтрацией биорезорбируемого матрикса и прилежащих к нему склеры и конъюнктивы. В воспалительном инфильтрате преобладают лейкоциты, отмечена начальная пролиферация фибробластов во всех исследуемых зонах (конъюнктиве, склере и коллагеновом матриксе). Воспаление сопровождается постепенной резорбцией волокон матрикса (рисунок 28). Отток ВГЖ из передней камеры осуществляется через склеральный канал в субконъюнктивальное пространство.
Через 30 суток после имплантации единичные волокна гемостатической коллагеновой губки определяются в склеральном канале, в субконъюнктивальном пространстве отмечается менее выраженный лизис матрикса. Воспалительная клеточная реакция со стороны склеры и конъюнктивы уменьшается. Вместе с тем, отмечаются активная пролиферация фибробластов, рост грануляционной ткани и сосудов, преимущественно в склеральном канале. Выраженный ангиогенез отмечен в склере и в конъюнктиве глаз кроликов II группы (рисунки 29, 30).
На 60-е сутки после вмешательства отмечен полный лизис биорезорбируемого матрикса – гемостатической коллагеновой губки - у кроликов II группы. В зоне склерального канала и субконъюнктивальном пространстве выявлены остатки грануляционной ткани, представленной новообразованными сосудами, макрофагами, лимфоцитами, лейкоцитами и фибробластами, а также волокнами соединительной ткани. Воспалительная реакция в зоне конъюнктивы и склеры уменьшается. Отток ВГЖ осуществляется путем диффузии через тонкостенные новообразованные интра- и эписклеральные сосуды (рисунок 31).
У кроликов II группы через 90 суток после оперативного вмешательства просвет склерального канала и субконъюнктивальное пространство заполнены молодой рыхлой соединительной тканью. Тонкостенные интра- и эписклеральные сосуды образуют пути оттока ВГЖ в субконъюнктивальное пространство (рисунок 32).
В III группе животных (имплантация дренажа iGen) на 7 сутки после операции выраженная локальная воспалительная реакция сопровождается макрофагальной, лимфо-лейкоцитарной инфильтрацией дренажа iGen и прилежащих к нему склеры и конъюнктивы. В воспалительном инфильтрате преобладают лейкоциты, отмечена начальная пролиферация фибробластов во всех исследуемых зонах (склере, конъюнктиве и матриксе). Воспаление сопровождается выраженной резорбцией волокон дренажа iGen. Отток ВГЖ из передней камеры осуществляется через склеральный канал в субконъюнктивальное пространство (рисунки 33, 34).
К 30 суткам после имплантации наступает полная резорбция волокон iGen в склеральном канале и в субконъюнктивальном пространстве. Склеральный канал и частично субконъюнктивальное пространство заполнены зрелой грануляционной тканью, инфильтрированной макрофагами, лимфоцитами, большим количеством лейкоцитов и фибробластов. Выраженный ангиогенез отмечен в склере и в конъюнктиве глаз кроликов III группы. Отток ВГЖ в субконъюнктивальное пространство происходит преимущественно по новообразованным склеральным и эписклеральным тонкостенным сосудам (рисунок 35).
В III группе кроликов через 60 суток после имплантации iGen в области склерального канала и в субконъюнктивальном пространстве определяются остатки зрелой грануляционной ткани, представленной новообразованными тонкостенными сосудами, макрофагами, лимфоцитами, лейкоцитами и фибробластами, волокнами соединительной ткани. Отмечается выраженная пролиферация фибробластов и образование более грубых волокон соединительной ткани в ЭЦМ как в склере, так и в конъюнктиве, что свидетельствует о ремоделировании ЭЦМ с развитием фиброза. Отток ВГЖ осуществляется путем диффузии через тонкостенные новообразованные интра- и эписклеральные сосуды (рисунок 36).
На 90 сутки после хирургического вмешательства в III группе сохраняется активная пролиферация фибробластов и ангиогенез. В новообразованной плотной соединительной ткани отмечается моноцитарная инфильтрация с примесью лейкоцитов. Отток ВГЖ обеспечивается диффузией через тонкостенные новообразованные интра- и эписклеральные сосуды (рисунок 37).
Сравнительный морфометрический анализ состояния конъюнктивы и склеры II и III групп экспериментальных животных свидетельствует о сходной острой воспалительной реакции на 7 сутки после оперативного вмешательства. На сроках в 30, 60 и 90 суток у кроликов II группы отмечен достоверно (р 0,05) менее выраженный клеточный ответ в зоне конъюнктивы и склеры (таблица 9).
На всех сроках наблюдения выявлена отрицательная корреляционная связь между ангиогенезом и выраженностью процесса фиброзирования ЭЦМ в конъюнктиве (II группа: г7= -0,973, г30= -0,853, г60= -0,863, г90= -0,911, р 0,05, III группа: г7= -0,816, г30= -0,949, г60= -0,839, г90= -0,870, р 0,05) и в склере (II группа: г7= -0,853, г30= -0,986, г60= -0,816, г90= -0,863, р 0,05, III группа: г7= -0,905, г30= -0,872, г60= -0,870, г90= -0,870, р 0,05). Во II группе обнаруживается активный рост новообразованных тонкостенных сосудов конъюнктивы и склеры на 7, 30 и 60 сутки с постепенным его снижением к 90 суткам. При этом к 90 дню наблюдения отмечается частичное фиброзирование ЭЦМ конъюнктивы и склеры. В III группе животных выявлено уменьшение периода активного ангиогенеза в конъюнктиве и склере до 30 суток. Резкое снижение образования тонкостенных сосудов на 60 сутки сопровождается активным процессом фиброзирования ЭЦМ. Данная тенденция сохраняется к 90 суткам наблюдения.
Таким образом, результаты гистологического исследования конъюнктивы и склеры свидетельствуют о сходном клеточном ответе через 7 суток после имплантации гемостатической коллагеновой губки и дренажа iGen. В более поздние сроки наблюдения после введения гемостатической коллагеновой губки отмечается менее выраженная локальная воспалительная реакция тканей и активный ангиогенез, что способствуют медленному фиброзированию ЭЦМ конъюнктивы и склеры. Отсутствие признаков выраженного фиброза конъюнктивы и склеры в зоне имплантации гемостатической коллагеновой губки обеспечивает более выраженный отток ВГЖ по новообразованным тонкостенным сосудам в субконъюнктивальное пространство.
Динамика функциональных показателей
При сравнении показателей статической периметрии было выявлено статистически значимое повышение уровня стандартного отклонения (MD) и паттерна стандартного отклонения (PSD) (таблица 12).
По данным КЛСО отмечено статически значимое увеличение показателей площади и объема НРП, а также толщины СНВС через 6 и 12 месяцев после транслимбального микродренирования передней камеры с имплантацией биорезорбируемого антиглаукомного дренажа. Показатели дискриминантного анализа FSM и RB достоверно улучшились через 6 и 12 месяцев после операции (таблица 13).
Таким образом, достоверное улучшение послеоперационных показателей статической периметрии и КЛСО косвенно свидетельствуют об уменьшении компрессии ДЗН на фоне снижения ВГД.
Клинический пример
Пациентка Г., 75 лет, поступила в 2 х/о ФГБНУ «НИИ глазных болезней» с диагнозом: ОД Первичная открытоугольная глаукома IIC, артифакия, миопия слабой степени. Диагноз первичная открытоугольная глаукома поставлен в 2006 г., назначен гипотензивный режим. Антиглаукомных операций в анамнезе нет. Факоэмульсификация с имплантацией ИОЛ на правом глазу выполнена в 2008 г. При поступлении: острота зрения правого глаза 0.7 sph-1.0 = 1.0. ВГД роговично компенсированное 30,0 мм рт.ст. (гипотензивный режим: бримонидин 0,15% 3 р./сутки, бринзоламид + тимолола малеат 2 р./сутки, латанапрост 0,005% 1 р./сутки). Объективно: конъюнктива спокойная, отделяемого нет, роговица прозрачная, передняя камера средней глубины, влага прозрачная, радужка субатрофична, пигментная кайма частично выщелочена, зрачок круглый, реакции на свет живые. ИОЛ в капсульном мешке, центрирована. Глазное дно: ДЗН монотонный, ЭД = 0.7 ДД, сосудистый пучок смещен в носовую сторону, ангиосклероз, артерии сужены, вены полнокровны, в макулярной зоне диссоциация пигмента. Гониоскопия: угол передней камеры широко открыт, умеренная экзо- и эндогенная пигментация. Пациентке была выполнено транслимбальное микродренирование передней камеры с имплантацией биорезорбируемого антиглаукомного дренажа. Операция и послеоперационный период без осложнений. В послеоперационном периоде пациентке назначена антибактериальная и противовоспалительная терапия (тобрамицин+дексаметазон 4 р./сутки, индометацин 4 р./сутки в течение 7 суток, затем по убывающей схеме в течение 3 недель). На 1 сутки после операции ВГД составило 4,4 мм.рт.ст.. На 7 сутки ВГД равно 4,6 мм рт.ст.. При биомикроскопии отмечается умеренная васкуляризация конъюнктивы, фильтрационная подушка разлитая, передняя камера средней глубины, влага прозрачная (рисунок 47). Явлений ЦХО не отмечали. Через 1 мес. ВГД 9,0 мм рт.ст., по данным оптической когерентной томографии зоны фильтрационной подушки выявлена частичная резорбция дренажа, признаков рубцевания склерального канала и субконъюнктивального пространства нет (рисунок 48). Через 6 мес. после вмешательства ВГД 9,5 мм рт.ст., через 12 мес. – 11,3 мм рт.ст. без гипотензивного режима. Данные статической периметрия Humphrey и КЛСО без отрицательной динамики.