Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы
1.1. Облепиха крушиновидная как источник биологически активных веществ 7
1.2. Фармакологические свойства препаратов облепихи и ее использование в народной медицине 11
1.3. Препараты растительного происхождения, обладающие противоязвенной активностью 16
1.4. Заключение 24
Глава 2. Материалы и методы исследования
2.1. Материалы и методы исследования, используемые при изучении химического состава БАВ коры и побегов облепихи и стандартизации полученных препаратов 26
2.1.1. Методы исследования, используемые при изучении химического состава липофильной фракции БАВ .30
2.1.2. Методы исследования, используемые при изучении химического состава гидрофильной фракции БАВ 39
2.1.3. Методы исследования, используемые при изучении физико-химических показателей 46
2.2. Материалы и методы исследования, используемые при изучении противоязвенной активности препаратов коры и побегов облепихи 47
Глава 3. Результаты эксперимента
3.1. Изучение химического состава БАВ коры и побегов облепихи
3.1.1. Изучение химического состава БАВ липофильной фракции 51
3.1.2. Изучение химического состава БАВ гидрофильной фракции 60
3.2. Разработка технологии и стандартизация препаратов коры и побегов облепихи.72
3.2.1. Масляный экстракт коры и побегов облепихи 73
3.2.2. Жидкий экстракт коры и побегов облепихи 83
3.2.3. Сухой экстракт коры и побегов облепихи 92
3.2.4. Масляный экстракт шрота коры и побегов облепихи 97
3.3. Сравнительное изучение противоязвенных свойств экстрактов коры и побегов облепихи
3.3.1.Нейрогенная язва желудка 99
3.3.2. Ацетилсалициловая язва желудка 103
3.3.3. Изучение влияния экстрактов коры и побегов облепихи на развитие реакции острого стресса у мышей 105
Глава 4. Обсуждение полученных результатов 109
Общие выводы 128
Список литературы 129
- Облепиха крушиновидная как источник биологически активных веществ
- Методы исследования, используемые при изучении химического состава гидрофильной фракции БАВ
- Масляный экстракт коры и побегов облепихи
- Изучение влияния экстрактов коры и побегов облепихи на развитие реакции острого стресса у мышей
Введение к работе
Актуальность темы. Нерациональность использовании сырья и несовершенство гехнологий переработки в ряда отраслей народного хозяйства (химическая индустрия:, энергетика, фармацевтическая промышленность и т.д.) обернулись для биосферы мощ-яым антропогенным давлением: загрязнением промышленными отходами, снижением продуктивности возобновляемых биологических ресурсов, в том числе растительного происхождения. Поэтому в последнее время становится крайне актуальным рациональное и комплексное использование сырьевых источников, в частности, лекарственно-технического сырья. Одним из аспектов этой многоплановой проблемы является создание экономичных, малоотходных и экологически безвредных технологий переработки растительных материалов.
В свете такого комплексного подхода к использованию ценного лекарственно-технического сырья заслуживают внимания уникальные растения сибирской флоры, одним из которых является облепиха крупшновидная Htppopbae rhamnoides L., семейство лоховые (Elaeagnaceae), содержащая целый комплекс биологически активных и питательных веществ, обладающих ценнейшими биолого-фармакологическими свойствами. Однако, несмотря на содержание биологически активных веществ (БАВ) во всех частях растения, применение в медицинской, пищевой и косметической промышленности получили только плоды и листья облепихи (масло облепиховое, аэрозольные препараты "Олззоль" и "Тишзоль", сок облепиховый я т.д), в то время как кора и побеги растения практического применения не нашли и являются отходами плановых агротехнических мероприятий по возделыванию облепихи. Так, по данным НИИ садоводства Сибири им. М.А Лисавенко, ежегодный объём проводимой в садах промышленного назначения Алтайского края реконструкции позволяет иметь 230-350 тонн надземной биомассы облепихи крушиновидной, из которых с учетом влажности ежегодно можно получить до 35-50 тонн сухой смеси коры и побегов облепихи.
Все вышеизложенное, а также сведения этномедидюгы о применении коры и побегов облепихи при лечении заболеваний желудочно-кишечного тракта свидетельствуют о целесообразности и своевременности проведения химических, технологических и биологических исследований для решения проблемы малоотходного комплексного использования ценнейшего растения Сибири - облепихи круишновидной.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей диссертационной работы явилось теоретическое в экспериментальное обоснование возможности использования в хачест-
вс сырья для производства противоязвенных препаратов отходов, получаемых при проведении плановых агротехнических мероприятий по возделыванию облепихи кру-шиновидной, - коры и побегов.
Дя» дрстуяскшт» ппегаипЕнипи дели предстояло репппъ сдедуюшив задачи:
провести изучение химического состава лшюфильной и гидрофильной фракций БАВ коры и побегов облепихи;
разработать ресурсосберегающие технологии масляного, жидкого и сухого экстрактов коры и побегов облепихи и провести их стандартизацию;
предложить схему комплексной переработки сырья облепихи;
изучить защитное действие экстрактов коры и побегов облепихи на слизистую обо-лочку желудка животных при различных моделях экспериментальных язв.
Научная новизна исследований. Впервые проведено детальное изучение химического состава лшюфильной и гидрофильной фракций БАВ коры и побегов облепихи, произрастающей на Алтае, по сравнению с официнальным сырьём обтепихи. Определены качественный состав и количественное содержание в исследуемом сырье суммы липофильных веществ и жирных кислот, тритерпеновьгх соединений, каротшгоидов, кунаринов, алкалоидов, дубильных веществ и фдавоноидов. Изучено влияние различных технологических факторов на процессы извлечения БАВ из ранее не исследованного сырья облепихи. Теоретически и экспериментально обоснован выбор показателей качества суммарных препаратов коры и побегов облепихи на основании данных о химическом составе сырья. Фармакологическими исследованиями установлено гастроза-щитное действие экспериментальных препаратов коры и побегов облепихи на слизистую оболочку желудка животных на фоне улывзрогенеза, вызванного ацетилсалициловой кислотой и нейрогенным воздействием.
Практическая значимость работы. Представленный в работе экспериментально-теоретический материал является доказательством и подтверждением возможности получения препаратов гастрозащитного действия из отходов, образующихся при проведении плановых агротехнических мероприятий по возделыванию промышленных плантаций облепихи (коры и побегов). Предложены и экспериментально обоснованы ресурсосберегающие технологии масляного, жидкого и сухого экстрактов коры и побегов облепихи, а также показана возможность их стандартизации по предложенным показателям норм качества. Разработана схема комплексной переработки исследуемого
сырья. Полученные данные позволяют рекомендовать новые препараты коры и побегов облепихи для лечения язвенной болезни желудка. По результатам проведенных исследований экстрактов коры и побегов облепихи подготовлены материалы, характеризующие специфическую активность, для разрешения Фармакологическим комитетом МЗ РФ клинических испытаний.
Положения, выдвигаемые на зашиту:
результаты фитохимических, технологических и фармакологических исследований отходов возделывания облепихи крупгяновидной в качестве дополнительного источника БАВ для получения противоязвешшх препаратов;
теоретическое и экспериментальное обоснование возможности рационального комплексного использования коры и побегов облепихи для производства суммарных экстракционных препаратов.
Связь задач исследования с проблемными программами. Диссертация выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ АГМУ на 1997 год
Апробация. Основные положения диссертации доложены на научно-практической конференции НПК" Актуальные вопросы фармацевтической науки и практики" (Курск, 1991г.), на НПК "Достижения фармацевтической науки и образования - практическому здравоохранению" (Пермь, 1997г.), на НПК "Достижения современной фармацевтической науки к практики на рубеже ХХЗ века" (Курск, 1997г.), на I межрегиональной фармацевтической конференции "Актуальные вопросы фармации на современном этапе" (Новосибирск, 1998г.), на V Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 1998г.), на итоговой научной конференции молодых ученых "Актуальные проблемы медицины и фармапии"(Курск, 1998).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ.
Структура и объём диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, четырех глав, общих выводов, списка цитируемой литературы (195 ссылок) и приложения. Материалы диссертации изложены т/43 страницах машинописного текста, включающего 56 таблиц и 15 рисунков.
Исследования фармакологической активности препаратов облепихи проводили на базе НИИ фармакологии Томского научного центра РАМН под руководством ст. науч. сотр., канд. биол. наук Зуевой Е.П.
Облепиха крушиновидная как источник биологически активных веществ
Облепиха крушиновидная (Hippophae rhamnoides Ь.) - кустарник или дерево семейства лоховых (Elaeagnaceae), высотой 1,5..,6,0 м, с буро-зеленой или черной корой и многочисленными ветвями с колючками длиной 2...7 мм. Листья очередные, короткочерешковые, линейно-ланцетные, темно-зеленого цвета сверху и серебристые снизу. Цветки двудомные, мелкие и невзрачные, собраны в колосовидную кисть. Плоды - сочные оранжевые костянки, густо облепляющие концы ветвей. Цветет в апреле-мае одновременно с распусканием листьев, плоды созревают в августе-сентябре.
Ареал распространения облепихи крушиновидной весьма обширен и включает значительную часть Европы и Азии. В России облепиха произрастает во многих регионах, но основные ее массивы находятся на Алтае, в Туве, в южной части Бурятии [10]. Кроме этого, большие заросли имеются в Средней Азии, в южных областях Казахстана, на Кавказе, в дельте Дуная и на побережье Балтийского моря [58, 65].
Для большего удовлетворения потребности в плодах облепихи в 70...80-ых годах.проведена всесторонняя селекционная работа по выведению новых перспективных её сортов, созданы высокопродуктивные промышленные насаждения облепихи [58, 151].
Технология выращивания культуры предусматривает ежегодную вырубку семи-восьмилетних малоплодоносящих деревьев и ежегодную обрезку одно-двухлетних побегов облепихи. Данный комплекс мероприятий повышает эффективность плодоношения и облегчает сбор плодов, но не предусматривает использования коры различных частей выкорчеванных растений, а также побегов, полученных при обрезке. Все это нельзя признать целесообразным в плане комплексной переработки сырья, так как и кора, и побеги облепихи содержат целый комплекс БАВ различной природы.
Использование облепихи как ценного лекарственного сырья обуславливает широкую изученность её химического состава, которая не равноценна для различных частей растения. В настоящее время довольно глубоко исследован состав БАВ плодов облепихи, значительно слабее изучен химический состав коры, листьев и других частей растения, причем большая часть работ, посвященных их изучению, появилась в последние два десятилетия [ЮЗ, 132, 153, 171].
По данным ряда исследователей, все части растения, в частности, плоды облепихи являются поистине кладовой разнообразных БАВ [86, 113]. Большую ценность представляют плоды облепихи как редкое витаминосодержащее и масличное сырье, имеющее промышленное значение [9, 178]. В настоящее время в плодах установлено наличие 10 витаминов, из которых 6 водорастворимых и 4 жирорастворимых [25]. В плодах всех изученных сортов и популяций облепихи найдены каротиноиды, при этом их суммарное содержание подвержено значительной изменчивости: от 0,31 до 20,0 мг%. В состав каротиноидов плодов облепихи входят фитофлюин, Р-каротин, у-каротин, поли-цис-ликопин В, ликопин, зеаксантин, неокаротин, лютеин, криптоксантин, изокриптоксантин, виолаксантин, неоксантин [54, 102, 178, 192]. Кроме этого, в плодах идентифицированы витамин С и витамины группы В: Вх В2, Вб, в небольших количествах никотиновая и фолиевая кислоты, токоферолы, филлохи-ноны[29, 151, 178, 184].
Одним из важнейших показателей, определяющих качество плодов, является маслич-ность, которая колеблется в широких пределах: 1,89...13,70% для свежих и 16,16...41,90% для сухих плодов [35, 46, 178]. Детально изучен химический состав облепихового масла, в частности, его неомыляемой фракции, отвечающей за фармакологическую активность [37, 54, 70, 141]. В настоящее время установлен жирнокислотный состав облепихового масла [82, 83, 186] и соотношение между отдельными фракциями насыщенных и ненасыщенных жирных кислот [86, 96], общее число которых равно 20 [79].
В составе липофильной фракции плодов облепихи обнаружены тритерпеноиды ряда а-амирина, представленные урсоловой кислотой в количестве 1,34...1,60% [103, 165, 189].
В плодах облепихи найден ряд соединений фенольного характера, преимущественно фенолокислот: хинной, кофейной, хлорагеновой кислот [9, 25]. Количественное"содержание дубильных веществ колеблется 0,025...0,530% [104, 177]. Плоды облепихи - богатый источник флавоноидов, которые представлены главным образом флавонолами подгруппы кверце-тина и изорамнетина в свободном виде и в виде 3-0- и 7-О-гликозидов [121, 122, 190] и, в меньшей степени, катехинами и антоцианидинами, большинство из которых идентифицированы в настоящее время [151].
Высокое содержание органических кислот (1,04...4,46%) и Сахаров (1,00...3,26%), состав которых неоднороден, определяет использование плодов облепихи в качестве ценного пищевого продукта [1, 9, 177]. В плодах обнаружен также пектин [2, 150].
В результате изучения аминокислотного состава были выделены аланин, фенилаланин, глутамин, цистеин, лейцин и определено их количественное содержание [92, 148]. Исследование минерального состава позволило идентифицировать в плодах 15 микроэлементов, среди которых железо, магний, алюминий, цинк, кобальт, марганец, медь и другие, а также соли натрия, калия и кальция [38]. Кроме того, обнаружены абсцизовая кислота [48] и предельные спирты нормального строения Сі8-С2б [140].
Из вышеизложенного следует, что в настоящий момент сравнительно хорошо известен химический состав плодов облепихи, являющих ценным масличным и витаминным сырьём, имеющим промышленное значение. Химический состав других частей ещё недостаточно изучен. Это относится, в частности, к изучению подземных органов облепихи. Исследование химического состава корней растения позволило обнаружить углеводы, лейкоантоцианы, катехины, флавоноиды, фенолкарбоновые кислоты и высшие жирные кислоты [86, 169].
Ряд работ посвящен изучению состава листьев облепихи, который весьма разнообразен. Особенно привлекает интерес исследователей липофильный комплекс из листьев как потенциальный заменитель масла плодов [52, 171], Установлены качественные и количественные показатели содержания в листьях жирного масла и исследован его жирно-кислотный и триацилглицеридный состав, В состав масла входят фосфолипиды (1,4%), а-, Р-, у-каротины, а-, р-, у- токоферолы, хлорофилл а и б, высшие жирные кислоты [76, 83],
Листья облепихи, как и плоды, богаты витаминами: витамином С [25, 86] и Е [139], каротиноидами, качественный состав которых несколько беднее по сравнению с плодами [139, 186]. При изучении состава тритерпеновых соединений листьев помимо урсоловой кислоты, содержание которой колеблется в пределах 0,29...0,39% [103], обнаружены тритер-пеновые соединения, отличные от тритерпеноидов плодов, в частности, олеаноловая кислота, а- и 3-амирин, лупеол, эритродиол, уваол и др.[139, 168]. Выявлено наличие в листьях квебрахита [131], а также высших алифатических спиртов нормального рядаС18-С25 [139].
В результате изучения гидрофильной фракции БАВ листьев был обнаружен ряд соединений фенольного характера: фенолкарбоновые кислоты и их производные, катехины, лейкоантоцианы и другие [9, 104, 173]. Флавоноидный состав листьев облепихи несколько разнообразнее, чем плодов. Общее содержание флавоноидов составляет 3,8...4,0% [170]. Среди флавоноидов листьев определены следующие флавонолы группы кемпферола, кверцетина и изорамнетина: мирицетин, изокверцитрин, З-р-Д-глюкофуранозил-Р-Д-глюкопирано-зид изорамнетина, 3-галактозилглюкозид кверцетина [100, 173], З-О-Р-Д-глюкопиранозидо-7-0-cc-L-рамнопиразид изорамнетина [132] и астрагалин [130].
По данным Букштынова А.Д., в листьях облепихи установлено наличие кумаринов -производных бензокумарина, в частности, эллаговой кислоты и оксикумаринов [25]. Содержание дубильных веществ в листьях варьирует в пределах 1,5...11,7% [Ю4, 167]. Изучение таниновой фракции позволило выделить четыре индивидуальных вещества [176].
В листьях облепихи, как и в плодах, обнаружены углеводы и родственные соединения: углеводы - 2,6%; пектин - 0,42% [9].
В середине 70-х годов начато изучение цветков облепихи. При этом установлено, что содержание углеводов составляет 1,2%; пектина - 0,2%. Витаминный состав цветков подобен составу других частей облепихи. В цветках обнаружены витамины С, Е, каротиноиды: а-, (3-каротин, лютеин, флавоксантин, криптоксантин, виолаксантин, неоксантин [192]. Фе-нольные соединения представлены хлорагеновой кислотой и флавонолами группы изорам-нетина и их гликозидами [188]. Содержание жирного масла в цветках - 0,9% [9].
В литературе имеются данные об изучении химического состава коры старых растений и молодых побегов облепихи. Так, из коры облепихи Массагетов П.С. в 1947 году выделил два вещества алкалоидной природы, один из которых был назван гиппофаином [86]. Неоднократные испытания Ambaye R.Y. и Indap М.А. подтвердили данные о содержании алкалоидов в коре растения [181]. Меньшиков Г.П. и Петрова М.Ф. выделили из экстракта коры облепихи комплекс азотистых оснований, условно названный Нг [114]. Позднее этим же авторам удалось выделить одно из оснований этой суммы и идентифицировать его как 5-окситриптамин (серотонин) [125]. По их данным, содержание 5-окситриптамина в коре колеблется в пределах 0,3...0,4%, что значительно превосходит его содержание в коре других растений [113, 114]. В 1964 году Петрова М.Ф., Меньшиков Г.П. и Кранц П.С. опубликовали простой способ получения серотонина из сырья облепихи [115].
Изучен фракционный и аминокислотный состав белков древесной зелени облепихи, среди которых обнаружены аланин, фенилаланин, глутамин и другие аминокислоты [136]. Содержание дубильных веществ в коре достигает 10% [25, 86].
В результате изучения липофильной фракции БАВ коры облепихи Ручкиным В.Н. было обнаружено жирное масло в количестве 3,1% с йодным числом 56,3, однако его качественный и количественный состав не был изучен [86]. Тритерпеновые соединения в коре представлены урсоловой кислотой, содержание которой колеблется 0,17...0,22% [103].
Методы исследования, используемые при изучении химического состава гидрофильной фракции БАВ
При изучении гидрофильной фракции БАВ коры и побегов облепихи исследовали вещества, которые вносят определенный вклад в реализацию противоязвенного эффекта, в частности, суммы дубильных веществ и флавоноидов [15, 91]. Кроме того, по данным Петровой М.Ф., Меньшикова ГЛ., в коре облепихи обнаружено и впоследствии выделено вещество алкалоидной природы 5-окситриптамин в количестве, значительно превосходящем его содержание в коре других растений [114, 115], что в дальнейшем было подтверждено на кафедре ФТ АГМУ [34]. Несмотря на то, что в данных литературы не найдено сведений о противоязвенном действии этого вещества, его высокая биологическая активность как вещества алкалоидной природы и достаточно значительное содержание послужили основанием для изучения суммы алкалоидов в коре и побегах облепихи и в препаратах из данного сырья.
При исследовании качественного состава БАВ гидрофильной фракции и их количественном определении были использованы стандартные фармакопейные методики и методики, разработанные в ходе эксперимента.
КАЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ ФЛАВОНОИДОВ
Предварительная информация об основных структурных элементах флавоноидных соединений была получена с использованием качественных реакций, которые также позволили отнести исследуемые соединения к определенному классу [23, 33, 163]. Обнаружение флавоноидов проводили с помощью следующих реакций: цианидиновая проба и ее модификация по Брианту, с водно-этанольным раствором гидроксида натрия, с хлоридом алюминия, с реактивом Вильсона (борная и лимонная кислоты, растворенные в безводном ацетоне), с раствором ванилина в присутствии концентрированной хлористоводородной кислоты [33, 64]. Поскольку тип флавоноидов (состав агликона и сахарной части, характер гликози-дирования, полярность и т.д.) изучаемого сырья облепихи в настоящее время не известен, их извлечение из сырья осуществляли с использованием экстрагентов различной полярности: воды и 70 этанола [163]. Для этого 1,0 г измельченного сырья (1мм) помещали в колбу со шлифом и заливали 20 мл экстрагента. Содержимое колбы нагревали на водяной бане при слабом кипении в течение 3 часов с обратным холодильником. Охлажденное извлечение фильтровали и использовали для проведения вышеперечисленных качественных, реакций.
Разделение и идентификация флавоноидных соединений сырья были проведены методом бумажной и тонкослойной хроматографии. Бумажную хроматографию проводили с использованием наиболее часто применяемых при хроматографическом исследовании флавоноидов систем растворителей: н-бутанол - ледяная уксусная кислота - вода (4:1:5); ледяная уксусная кислота - вода (15:85); ледяная уксусная кислота - вода (60:40); м-крезол - уксусная кислота - вода (50:2:48) [36]. Хроматографированию как на бумаге, так и в тонком слое сорбента подвергали этанольные извлечения сырья, полученные по следующей методике: пробу сырья, измельчённого до размера частиц 1 мм, массой 2,0 г заливали 100 мл 70 этилового спирта и настаивали при комнатной температуре в течение суток, после чего извлечение фильтровали через бумажный фильтр и упаривали под вакуумом до половины объема.
На стартовую линию хроматографической бумаги "Ленинградская медленная" наносили микрокапилляром 0,1 мл полученного извлечения и хроматографировали при комнатной температуре в вертикальной камере, предварительно насыщенной в течение 24 часов. После хроматографирования бумагу высушивали при комнатной температуре до полного исчезновения запаха растворителей. Полученные хроматограммы просматривали в УФ-свете до и после обработки их реактивами, при этом отмечали цвет флюоресценции и определяли величину Rf полученных пятен. В работе были использованы реактивы, способные образовывать окрашенные и флюоресцирующие в УФ-свете соединения [14].
Хроматографирование в тонком слое сорбента проводили по следующей методике [163]: 0,05 мл извлечения наносили микрокапилляром на пластинку "Силуф.ол УФ-254" (150x150 мм) на расстоянии 1,5 см от края. Пластинку подсушивали на воздухе и хроматографировали восходящим способом в двух системах растворителей: н-бутанол - ледяная уксусная кислота - вода (4:1:5) и ледяная уксусная кислота - вода (15:85). Лучшее разделение флавоноидов было достигнуто в системе 15% уксусной кислоты, которая была использована в дальнейших исследованиях для хроматографирования. Качественными показателями при этом служили величина Rf и окраска пятен до и после обработки хромогенными реактивами
Для изучения структуры флавоноидных соединений, предварительно отнесенных к группе флавана, было проведено их выделение по методике извлечения катехинов из листа чая [56]: аналитическую пробу сырья, измельченного до размера частиц 1 мм, массой 3,0 г обрабатывали смесью бензол - хлороформ (1:1) в аппарате Сосклета в течение 24 часов до обесцвечивания. Сырье подсушивали на воздухе до исчезновения запаха растворителей, помещали в склянку с притертой пробкой, добавляли 100 мл этилацетата и настаивали в течение суток. Полученное извлечение фильтровали через бумажный фильтр, сушили в эксикаторе над прокаленным хлоридом кальция в течение 24 часов, после чего сгущали под вакуумом до половины объема. Сгущенный экстракт вливали тонкой струйкой в хлороформ, обезвоженный над хлоридом кальция в аналогичных условиях. Объем хлороформа в 4-6 раза превышал объем этилацетатного извлечения. Полученную смесь выдерживали в течение 10 суток в холодильнике при температуре -4С. Выпавший осадок отделяли фильтрованием через стеклянный фильтр №2 и промывали на фильтре обезвоженным хлороформом. Полученный продукт представлял собой легкий аморфный порошок светло-коричневого цвета, легко растворимый в этаноле. Для предотвращения окисления на воздухе выделенной из сырья суммы катехинов, данную фракцию растворяли в 96 спирте (1:10).
Полученный этанольный раствор суммы катехинов использовали для проведения качественных реакций и для хроматографических исследований. При этом применяли следующие реагенты: 1% раствор ванилина в концентрированной хлористоводородной кислоте; персульфат натрия в концентрированной серной кислоте; реактив Шталя (1% раствор п-диметиламинобензальдегида) и 1% раствор железоаммонийных квасцов [23, 56, 57].
Хроматографические исследования выделенной суммы БАВ проводили на пластинках "Силуфол УФ-254" (150x150 мм) в системе растворителей н-бутанол - уксусная кислота -вода (40:12:28) [56]. На хроматографическую пластинку наносили 0,1 мл этанольного раствора катехинов в виде полосы длиной 2,5 см. После хроматографирования пластинку высушивали на воздухе до исчезновения запаха растворителей отмечали собственную флюоресценцию в УФ-свете и окраску пятен после обработки хромогенными реактивами.
Для получения УФ-спектров поглощения этанольных элюатов пятен на хроматограмме отмеченные флюоресцирующие пятна объекта и контрольную зону чистого сорбента переносили в колбы со шлифом вместимостью 100 мл, заливали 20 мл 96 этанола, закрывали пробкой и элюировали в термостате при температуре 25С в течение 3 часов. После этого элюат отфильтровывали через бумажный фильтр и измеряли оптическую плотность в диапазоне длин волн 220-370 нм на спектрофотометре СФ-46 в кювете с толщиной слоя 10 мм. Измерение проводили с шагом 10 нм, вблизи максимумов поглощения - 2 нм, используя в качестве раствора сравнения элюат из контрольной зоны.
Наличие флавоноидных соединений в препаратах коры и побегов облепихи было доказано путем проведения реакций с хромогенными реактивами, аналогичными применяемым в качественном анализе сырья. Для качественного анализа использовали фильтрат водной суспензии сухого экстракта (1:10) и жидкий экстракт коры и побегов облепихи.
КАЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ ДУБИЛЬНЫХ ВЕЩЕСТВ
Для качественного обнаружения дубильных веществ в исследуемом сырье был применен комплекс реакций, которые позволяют не только обнаружить присутствие дубильных веществ в сырье, но и определить их принадлежность к той или иной группе дубильных веществ. Для качественного анализа готовили водные извлечения коры и побегов (1:10) [23, 163]. При этом были использованы реакции осаждения: с раствором желатина, с солями алкалоидов, с растворами дихромата калия, гидроксоацетата свинца, с бромной водой, с раствором формальдегида в присутствии концентрированной хлористоводородной кислоты и цветные реакции: с раствором железоаммонийных квасцов, с реактивом Фолина-Дениса (смесь фосфорновольфрамовой и фосфорномолибденовой кислоты). Наличие суммы дубильных веществ в сухом и жидком экстрактах определяли с помощью некоторых цветных и осадительных реакций, аналогичных реакциям обнаружения дубильных веществ в сырье - с 1% раствором желатина в 10% растворе хлорида натрия, с 1% раствором железоаммонийных квасцов, с раствором формальдегида в присутствие концентрированной хлористоводородной кислоты. Для обнаружения дубильных веществ в сухом экстракте было использован фильтрат водной суспензии препарата (1:10).
КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ СУММЫ ОКИСЛЯЕМЫХ ВЕЩЕСТВ
Проведенные нами исследования показали, что флавоноиды коры и побегов облепихи представлены в основном катехинами, которые являются предшественниками дубильных веществ (глава 3.1.2.). Принимая во внимание данный факт, а также то, что катехины, как и дубильные вещества являются легкоокисляемыми, в основу количественного определения обеих групп БАВ была положена фармакопейная методика, основанная на окислении данных веществ перманганатом калия с использованием в качестве индикатора индигосульфо-кислоты [43]. В пользу выбранной методики свидетельствуют данные последних исследоваНий в области фитохимии фенольных соединений, согласно которым при титровании по фармакопейной методике окислению подвергаются не только дубильные вещества, но и другие легкоокисляемые вещества, присутствующие в объектах исследования, в частности, сумма флавоноидов. Поэтому при обсуждении результатов анализа по методике ГФ-Х1 ( статья Определение содержания дубильных веществ в лекарственном растительном сырье), учитывая сложный комплекс входящих в него БАВ, данный комплекс обозначается как "сумма окисляемых веществ" [49].
Масляный экстракт коры и побегов облепихи
ПОЛУЧЕНИЕ МАСЛЯНОГО ЭКСТРАКТА
При изучении влияния технологических факторов на процесс экстрагирования БАВ липофильного характера методом математического планирования эксперимента были исследованы на трёх уровнях такие факторы как измельчённость сырья (А), температура (В) и продолжительность однократного настаивания (С) [95, 117].
Три уровня фактора А (измельчённость сырья) были выбраны в интервале, представляющем практический интерес Аг 5мм, Аг- 10мм, Аз- 15мм. Выбор был произведен на основании литературных данных и анатомо-морфологических особенностей сырья.
Уровни фактора В (температура) Bp 40С, Bz- 50С, Вз- 60С были выбраны с учётом того, что экстрагирование при температуре ниже 40С при производстве масляных экстрактов не приводит к эффективному извлечению БАВ липофильного характера, а нагревание до температуры выше 60С сопровождается деструкцией некоторых термолабильных веществ, в частности, каротиноидов [93].
Уровни фактора С (время однократного настаивания) Cг 6 часов, Сг- 12 часов, Сз- 24 часа были выбраны с учётом данных литературы и реальной обстановки, существующей на фармацевтических предприятиях (режим работы).
Экстрагентом являлось масло подсолнечное, для которого были определены основные физико-химические показатели по методикам ГФ-Х1 (глава 2.1.З.). Было установлено, что экстрагент по основным физико-химическим показателям соответствует маслу подсолнечному, используемому для производства медицинских препаратов (ГОСТ 1129-93). Соотношение сырьё; экстрагент составляло 1;2,92 , так как это соотношение обеспечивало образование "зеркала" над поверхностью сырья.
Методика исследования заключалась в следующем; 50 г смеси коры и побегов облепихи (2;8) различной измельчённости (от 5 до 15 мм) заливали 146 мл (134,3 г) подсолнечного масла и настаивали различное время (от 6 до 24 часов) при различной температуре (от 40Т до 60С) в термостате ТС 80 М-2. По истечении данного времени извлечение сливали и определяли содержание БАВ в истощенном сырье. Критерием эффективности экстрагирования служила истощенность сырья по каротиноидам. Данный выбор был сделан, исходя из предположения, что динамика извлечения каротиноидов - термолабильной группы веществ - отражает динамику извлечения других групп липофильных веществ.
Для установления значимости влияния выбранных технологических факторов был проведён полный дисперсный анализ, результаты которого представлены в табл. 24.
Как видно из данных, представленных в табл. 24, вычисленные значения отношений Р для всех групп факторов значительно превышают табличные данные критерия Фишера F2,88=3,55 что свидетельствует о значимости влияния всех трёх изученных групп факторов. Сравнение вычисленных отношений Р для групп факторов А, В и С позволяет расположить влияние факторов в следующем порядке; температура - время настаивания - измельчённость сырья.
Дальнейший анализ полученных данных с помощью множественного рангового критерия Дункана позволил построить ряд предпочтительности значений различных уровней каждого фактора. Результаты анализа представлены в сводной табл. 25.
Анализируя данные этой таблицы, можно построить следующий ряд значений фактора А (измельченность) 5мм 10мм 15мм и фактора В (температура) 60С 50С 40С в по-рядке уменьшения их значимости что позволяет выбрать оптимальную измельченность исследуемого сырья, соответствующую 5 мм, и температуру экстрагирования, равную 60С.
Анализ значимости различий для фактора С (время однократного настаивания) показал, что равновесное состояние в системе наступает в интервале времени 6... 12 часов. С целью уточнения оптимального времени настаивания (времени достижения равновесного состояния) был проведён ряд дополнительных опытов. Методика их проведения заключалась в следующем: смесь коры и побегов облепихи (2:8) массой 10,0 г, измельченных до размера частиц 5 мм, загружали в диффузор в несколько приёмов для более плотной укладки. Сырьё заливали 29 мл подсолнечного масла и экстрагировали при оптимальной температуре (60Т) в течение 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 и 13 часов. По истечении указанного времени масляное извлечение сливали и определяли истощенность сырья по каротиноидам. На основании полученных данных был построен график зависимости степени истощения сырья от времени экстрагирования, который представлен на рис. 11.
Изучение изменения степени истощения сырья во времени показало, что состояние, близкое к равновесию, наступает при десятичасовом настаивании.
Таким образом, в результате проведенньгх исследований установлены оптимальные условия для извлечения липофильных веществ коры и побегов облепихи: температура 60"С, измельченность сырья до размера частиц 5 мм, время однократного настаивания 10 часов.
С учётом выбранных в ходе эксперимента вышеперечисленных оптимальных условий была разработана технология масляного экстракта способом многоступенчатого противо-точного экстрагирования, наиболее часто применяемого в промышленном производстве масляных экстрактов [93, 95]. Технология заключалась в следующем: в шесть диффузоров загружала смесь коры и побегов облепихи (2:8), измельчённых и просеянных через сито с отверстиями диаметром 5 мм (ГОСТ 214-83), массой 50,0 г в несколько приемов для более плотной укладки. В первый диффузор заливали 146 мл (134,3 г) подсолнечного масла, помещали в термостат ТС 80 М-2 и настаивали при температуре 60С в течение 10 часов. По истечении времени экстрагирования извлечение из первого диффузора сливали, измеряли его объём, доводили его до 146 мл подсолнечным маслом и заливали во второй диффузор. В первый диффузор заливали 146 мл (134,3 г) свежего экстрагента и настаивали в термостате при температуре 60С в течение 10 часов, одновременно настаивали второй диффузор. В дальнейшем слив извлечений, залив экстрагента и термостатирование проводили в аналогичных условиях, соблюдая принцип противотока, согласно которому свежий экстрагент двигался навстречу наиболее истощённому сырью. Слив из последнего (шестого) диффузора являлся готовой продукцией. Последовательно все диффузоры становились "концевыми". По разработанной технологии были получены пять серий масляного экстракта.
Для оценки рациональности разработанной технологии на основании данных, полученных при стандартизации препарата, был рассчитан выход по основным БАВ. Определение БАВ в масляном экстракте проводили по методикам, изложенным в главе 2.1.1. Расчет практического выхода основных БАВ в процентах (X) проводили по формуле: где Еф- фактический объём экстракта, мл; О- масса сырья в 6 диффузорах, г; Хг содержание основных БАВ в сырье, %; Хг- содержание основных БАВ в масляном экстракте, %.
Результаты расчёта практического выхода масляного экстракта по основным БАВ представлены в табл. 26, из которых видно, что разрабатываемая технология позволяет достигнуть довольно высокого выхода всех БАВ коры и побегов облепихи. Наибольший выход (до 95,16%) достигается по каротиноидам- более термолабильной группы БАВ, что, в свою очередь, свидетельствует о рациональном режиме экстрагирования БАВ.
СТАНДАРТИЗАЦИЯ МАСЛЯНОГО ЭКСТРАКТА
Полученный масляный экстракт представлял собой маслянистую жидкость красно-коричневого цвета со слабым специфическим запахом и терпким вкусом.
Для выбора показателей качества, по которым в дальнейшем может быть стандартизирован масляный экстракт коры и побегов облепихи, также было проведено качественное и количественное определение в экстракте таких БАВ, как каротиноиды, урсоловая кислота, кумарины. При этом использовали методики, аналогичные методикам определения упомянутых веществ в сырье с некоторыми модификациями, суть которых изложена в главе 2.1.1.
Для качественного обнаружения каротиноидов использовали цветную реакцию с хлороформным раствором хлорида сурьмы (III). Содержание суммы каротиноидов в пересчете на (3-каротин в масляном экстракте определяли спектрофотометрическим способом по методике ФС 42-1730-86. Присутствие в препарате урсоловой кислоты было доказано качественной реакцией Либермана-Бурхарда. Количественное определение урсоловой кислоты осуществляли спектрофотометрическим способом по методике Муравьёва И.А.- Шатило В.В. Для качественного обнаружения кумаринов в препарате использовали реакции образования азо-красителя и лактонной пробы, а также хроматографирование в тонком слое сорбента. Количественное определение суммы кумаринов в масляном экстракте проводили хроматоспек-трофотометрическим методом в пересчёте на псорален.
Результаты качественного и количественного определения БАВ липофильного характера в масляном экстракте представлены в табл. 27.
Результаты хроматографического анализа кумаринов масляного экстракта представлены в табл. 28.
Изучение влияния экстрактов коры и побегов облепихи на развитие реакции острого стресса у мышей
После стрессорного воздействия у мышей наблюдалась резкая инволюция селезенки, тимуса и надпочечников: их масса достоверно уменьшилась в 1,9; 1,8 и 1,6 раз соответственно по сравнению с группой контрольных животных. Интересно отметить, что масса надпочечников у мышей группы "стресс-контроля" оказалась меньше, чем у здоровых животных, что может свидетельствовать об истощении их функциональной активности при воздействии сильного раздражителя. У 80% подопытных особей группы "стресс-контроля" были обнаружены изъязвления на слизистой оболочки желудка, а среднее число язв на одно животное составляло 2,1+0,41 (табл. 47).
Применение масляного, жидкого и сухого экстрактов коры и побегов облепихи в исследуемых дозах не приводило к резкому увеличению селезёнки, лишь введение жидкого экстракта в дозе 5 мл/кг препятствовало атрофии селезенки (Ри 0,05). Отмечено, что масляный экстракт в дозе 5 мл/кг оказывает тормозящее влияние на процесс инволюции тимуса, выражающееся в достоверном увеличении массы вилочковой железы после стресс-воздействия. Количество изъязвлений на слизистой оболочке желудка мышей при применении масляного (1 и 5 мл/кг), жидкого (5 мл/кг) и сухого (100 и 200мг/кг) экстрактов достоверно уменьшалось по сравнению со значением этого показателя в группе "стресс-контроля" (Ри 0,05).
При определении интегральной степени выраженности стрессорной реакции организма группы животных, получавшие исследуемые препараты в различных дозах, расположились следующим образом: самую большую сумму баллов имела группа контрольных животных, подвергнутых стрессу (табл. 48, 49, 50). При введении сухого экстракта в дозе 100 мг/кг был умеренный защитный эффект на фоне острого стресса при разнице баллов, равной двум, по сравнению с контрольными животными. Однако увеличение дозы сухого экстракта не привело к усилению антистрессорного действия (табл. 50). Высокая защитная активность была обнаружена у масляного и жидкого экстрактов в дозе 1 мл/кг (разница в баллах равна 4). Показано, что максимальная эффективность использования масляного экстракта для угнетения стрессорных воздействий проявилась при увеличении дозы до 5 мл/кг (разница 6 баллов), в то время как аналогичное увеличение дозы жидкого экстракта лишь в незначительной степени изменяло эффективность его защитного действия по сравнению с дозой 1 мл/кг. Так, разница в баллах между контрольной группой животных и получавших жидкий экстракт в дозе 5 мл/кг составляла три балла.
Таким образом, все исследуемые экстракты коры и побегов облепихи показали в эксперименте антистрессорную активность, которая в максимальной степени была выражена у масляного (1 и 5 мл/кг) и жидкого (1 мл/кг) экстрактов.
В настоящее время в производстве различных продуктов потребления, в том числе фи тохимических препаратов, крайне актуальной является проблема комплексного безотходного использования сырьевых источников, в частности, лекарственного растительного сырья. Рещение этой актуальной проблемы связано с разработкой технологий, позволяющих добиться максимального извлечения БАВ из растительного сырья, а также с изучением возможности использования растений, лишь частично применяемых в фитохимическом производстве, таких как облепиха крушиновидная.
Облепиха - ценное растение сибирской флоры, в плодах и листьях которого обнаружен целый комплекс БАВ, таких как жирные кислоты, тритерпеновые соединения, сахара и органические кислоты, комплекс витаминов, дубильные вещества, флавоноиды и т.д. Данные вещества обуславливают разностороннее лечебное и профилактическое действие как фармакопейных препаратов плодов и листьев облепихи (масло плодов, масло плодов и листьев и их дериваты), так и ряда пищевых продуктов на основе плодов (сок облепиховый, сироп, джем, витаминные добавки из плодов облепихи и т.д.). В настоящее время для более полного удовлетворения нужд пищевой и медицинской промышленности в плодах созданы специализированные плантации облепихи. Так, на территории Алтайского края 14 хозяйств занимаются выращиванием данной культуры, при этом площадь промышленных плантаций составляет около 3,8 тыс. га. Введение облепихи крушиновидной в культуру потребовало реализации комплекса агротехнических мероприятий, предусматривающих выкорчевку старых малоплодоносящих растений, а также обрезку растений с целью омоложения плантаций и формирования кроны. В результате этих мероприятий образуется большое количество неиспользуемых отходов. Так, по данным НИИ садоводства Сибири им. М.А. Лисавенко, с учётом принятой технологии выращивания облепихи ежегодный объём проводимой в садах промышленного назначения Алтайского края реконструкции позволяет иметь 230. .350 тонн надземной биомассы облепихи крушиновидной. При выходе предполагаемого сырья с учетом влажности 140... 150 кг с 1 тонны влажной биомассы можно получить до 35...50 тонн смеси коры и побегов облепихи. Эта масса потенциального сырья облепихи остается невостребованной.
Такой подход к проблеме переработки ценного сырья, требующего достаточно высоких затрат при возделывании, нельзя признать целесообразным, так как в литературе имеются отдельные сведения об обнаружении как в коре, так и в побегах облепихи различных групп БАВ (дубильные вещества, тритерпеновые соединения, алкалоиды и т.д.). Большая часть этих сведений, относящихся к периоду 50...60 годов, посвящена изучению сырья облепихи произрастающей в европейской части страны, а также в Азербайджане и Бурятии [11З, 133].