Введение к работе
Актуальность проблемы
Основной причиной сокращения численности и исчезновения ценн проходных видов рыб является усиливавшееся антропогенное воздействи В отличие от естественных эволюционных причин, оно резко ускорило ТЄ! преобразования фауны и изменило его направленность. Антропогенное во: действие становится все более многофакторным; возникает все болы» число синергических эффектов, которые, к сожалению, слабо изучеі (Карнаухов, 1994).
Самые различные формы негативного антропогенного влияния имеї часто одни и те же механизмы воздействия на рыб: нарушение миграциоі ных путей и жизненных циклов, нарушение гаметогенеза, гибель икры, лі чинок, молоди, гибель производителей, нарушение генофонда популяций і популяционной структуры, ухудшение экологических условий, В TOM 4HCJ кормовой базы, резкое сокращение доли ценных видов (Павлов, 1990).
Несмотря на многолетнюю практику, до сих пор не существует единь подходов и стратегии охраны и искусственного воспроизводства рыб. Of непризнанной становится в настоящее время точка зрения о необходимое! охраны не только видов и подвидов рыб, но и отдельных экологически форм, сезонных рас, а в ряде случаев и отдельных популяций (Miller 1972; Павлов и др., 1983; 1985; Nilsson, 1984; Thereetened animals... 1987; Barus et al.. 1988; Lowe-McConnel, 1990).
Важнейшим промысловым районом для трех коммерчески наиболее важ ных видов осетровых - белуги, русского осетра и севрюги - являете Каспийское море, где добывается около 90% всех мировых уловов осетро вых. Наиболее важным является волго-Каспийский район, поставляющи около 80.1% общей добычи осетровых Каспия. Падение промысловых улово русского осетра, севрюги и особенно белуги отражают снижение числен ности их популяций ( Khodorevskaya et al.. 1993; Иванов, 1997; Ходо ревская. 1997).
Около 36-40% осетра, 91% белуги и 30% севрюги, вылавливаемых Российской части Каспийского моря, имеют заводское происхождение (Ба ранникова. 1992; Baraimikova et al., 1993), что определяет особую важ ность искусственного воспроизводства осетровых как природоохранног мероприятия.
Проблемы искусственного воспроизводства осетровых стали еще боле актуальными в связи с продолжающимся спадом развития рыбохозяйственно отрасли, отсутствием четко работающей экономической и юридической ба зы. которая бы обеспечивала должный контроль за использованием природ ных ресурсов в стране, в целом, и на Каспии, в частности. В силу эти и ряда других причин искусственное воспроизводство осетровых в Росси
находится в сложном положении, для преодоления которого, наряду с мерами по обеспечению рыбоводных заводов необходимыми средствами для обеспечении нормального технологического режима работы, необходимо также внедрять и использовать новые альтернативные подходы в рыборазведении (Малютин, 1994). Одним из возможных альтернативных подходов к решению данных проблем является использование на осетровых рыбоводных заводах некоторых биологически активных веществ (БАВ), выполняющих роль биостимуляторов и протекторов от неблагоприятных воздействий окружающей среды в раннем онтогенезе.
Цели и задачи исследования
Цель работы - исследовать возможность использования биологически штивных веществ (БАВ) для повышения эффективности искусственного зоспроизводства осетровых в современных экологических условиях.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи.
-
Оценить влияние трех БАВ - нейропептидного препарата сыворотки срови кур биостимулирующей (СКБ), фитогормонального препарата эпина и ншгонуклеотидного препарата энкада в ранее выбранных оптимальных до-sax на выживаемость зародышей русского осетра на разных стадиях эмбри->генеза - от оплодотворения до выклева.
-
Определить роль температуры и неблагоприятных гидрохимических іакторов (соленость, дефицит кислорода) в десинхронизации развития и ерратогенезе молоди осетровых и поставить комплексный эксперимент по ценке влияния БАВ на возникновение дефектов развития на фоне действия тих факторов.
-
В производственнных условиях провести обработку части икры усского осетра одним из БАВ (эпин - производным фитогормона эпибрас-инолида) в период осеменения и обесклеивания и определить процент оп-одотворения обработанной и контрольной (необработанной) икры, процент ыклева, провести бонитировочный учет выращенной в прудах молоди.
-
Изучить влияние эпибрассинолида на время подвижности спермато-оидов разных видов осетровых. Оценить такое влияние при разных темпе-атурах среда, а также после криоконсервации. На основе этих работ соз
ать экспресс-метод для оценки качества разных партий этого препарата.
-
Провести производственную проверку использования биологически істивного вещества эпибрассинолида в эмпирически подобранных концент-іциях на выживаемость эмбрионов на ранних этапах онтогенеза русского ;етра.
-
Дать практические рекомендации по применению биологически ак-геного вещества эпибрассинолида в практике осетровых рыбоводных завода для русского осетра.
Научная новизна работы
Впервые проведен сравнительный анализ эффективности различных биологически активных веществ нейропептидной (СКВ), олигонуклеотидной (энкад) и фитогормональной (эпин) природы на выживаемость и развитие зародышей осетровых рыб.
Проведено оригинальное исследование непосредственного воздействия фитогормона эпибрассинолида в виде растворов эпина с крайне низкими концентрациями по действующему веществу (10~4 - 10"9 мг/л) на организмы животного происхождения, в частности, на осетровых рыб, на ранних стадиях онтогенеза.
Установлено, что обработка эпином икры русского осетра и севрюги на стадии осеменения и обесклеивания имеет безусловно положительный эффект, повышая процент оплодотворения икры и процент выклева личинок на 5-20% по сравнению с контролем (икрой от тех же самок без обработки), причем этот эффект был тем более выражен, чем худшие исходные результаты были у икры от данной самки (эффект "чем хуже,тем лучше").
Показано, что добавление в активирующую среду определенных доз эпибрассинолида увеличивает время подвижности сперматозоидов до их полной остановки, т.е. благоприятно воздействует на жизнедеятельность клеток, что должно сказаться на проценте оплодотворения и жизнеспособности будущего потомства. Обнаружены температурные зависимости этих эффектов.
Установлено, что наиболее выраженное действие этого биорегулятора отмечается в неблагоприятных условиях, когда сильно сниженная подвижность спермиев в критических ситуациях снова повышается в 1.5-3 раза, хотя и не достигает контрольных величин.
Способ обработки икры осетровых эпибрассинолидом оформлен в виде заявки на изобретение N 97117958/ 13(018477) ОТ 21.10.97).
Теоретическая и практическая значимость работы.
Полученные результаты могут значительно дополнить имеющиеся сведения о некоторых биологических активных веществах (БАВ) и помогут более конкретно понять механизм воздействия новых препаратов на ранние этапы онтогенеза осетровых. Так как в работе с осетровыми данные БАВ, и в частности, зпибрассинолид. использованы нами впервые, это дает возможность на основе представленного материала показать наиболее перспективные направления для дальнейших исследований в указанной области. Практический интерес представляет вынесенное на основании производственных испытаний предложение о возможности использования эпина в осетроводстве, как биопротектора от влияния некоторых неблагоприятных экологических воздействий, а также способ биотестирования актив-
ности этого препарата на сперме осетровых. По материалам работы- подго- ; товлена заявка на изобретение, готовятся методические указания для рыбоводов. Собранный обзор литературных данных, а также собственные результаты работы о состоянии и перспективах развития осетроводства в свете экологических и технологических проблем используются в лекционном курсе по осетроводству и на практических занятиях студентов рыбо-хозяйственного факультета АГТУ. Они могут войти в лекционные и практические курсы обучения студентов рыбохозяйственных специальностей других ВУЗов.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доло-кены на Международной конференции "Экология и регион" (Ростов-на-Дону, 1995), на Международной конференции "Каспий - настоящее и будущее" (Астрахань. 1995). на Студенческих научно-технических конференциях Астраханского государственного технического университета 1996-1997 :т.. на Научно-технических конференциях профессорско-преподовательско-го состава Астраханского государственного технического университета L997-1998 гг., на Первом конгрессе ихтиологов России (Астрахань, 1997)
m I Международной конференции Ассоциации Прикаспийских государств [Астрахань, 1998). на III Ассамблее ассоциации университетов Прикас-шйских государств (Актау. 1998).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 работ. 4 работы гаходятся в печати.
Стуктура и объем диссертации. Диссертация изложена на 134 страни-[ах машинописного текста, иллюстрирована 5 рисунками и 21 таблицей, 'абота состоит из введения. 6 глав, результатов обсуждения и их заклю-іения, выводов, практических рекомендаций и списка цитируемой литера-уры. который включает 235 источника, из них 71 иностранных. Приложе-ия изложены на 46 страницах.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Работа была выполнена в течение 1995-1998 гг. и включала в себя етыре этапа. В 1995 г. выполнены экспериментальные работы в лаборато-ии и на производственных участках Кизанского осетрового рыбоводного авода (КОРЗ, Астраханская область) с использованием трех биологически ктивных веществ. В 1996 г. проведены производственные эксперименты і производственная проверка разработанного способа на одном из ранее | спытанных веществ) в цехах Лебяжьего осетрового рыбоводного завода '; ЛОРЗ). Разработку экспресс-биотеста проводили в 1997 г. в лаборатори-
ях Лебяжьего и Кизанского ОРЗ и в Проблемной лаборатории осетроводства АГТУ. Логическим завершением предыдущих работ явилась проведенная в 1998 году на ЛОРЗ и КОРЗ производственная проверка.
Объектом исследований являлись икра, личинки и молодь русского осетра, развивающиеся эмбрионы севрюги, а также сперма белуги, русского осетра и севрюги. Всего использован материал от 49 самок и 12 самцов русского осетра (Acipenser gueldenstaedti), 2 самок и 9 самцов севрюги (Acipenser stellatus). 2 самок и 16 самцов белуги (Huso huso).
Постановка экспериментов по воздействию различных биологически активных веществ на выживаемость и развитие эмбрионов осетровых рыб Икру от каждой самки, выделенной для проведения эксперимента, делили на четыре части, каждую из которых помещали в отдельный эмалированный таз. Три части были опытными, их подвергали обработке биологически активными веществами (БАВ); четвертая часть служила контролем.
Растворы биологически активных веществ вносили непосредственно в тазы дважды:' при осеменении, сразу после добавления раствора спермы (осеменение производили полусухим способом) и при обесклеивании, после внесения суспензии активного ила. Соответственно, время воздействия БАВ на икру составляло 3 мин в период осеменения + 45 мин в период обесклеивания вручную и в аппаратах АОИ.
Из большого количества потенциально пригодных БАВ были выбраны:
сублимированный препарат из сыворотки крови кур биостимулирую-щий (СКБ). содержащий комплекс нейропептидов биостимулирующего и регулирующего действия, в концентрации 400 мг/л;
препарат "эпин" - раствор синтетического фитогормона эпибрасси-нолида из семейства брассиностероидов в спирте и поверхностно активном веществе (ПАВ), известный в растениеводстве как мощный регулятор имму-ной системы и стимулятор роста, в дозе 10"4 мг/л по действующему веществу (эпибрассинолиду);
препарат "энкад", представляющий собой водный раствор олигонук-леотидов - продуктов специфического ферментативного гидролиза дрожжевой РНК. в концентрации 5 мг/л по рибонуклеотидам.
После обесклеивания экспериментальные и контрольные партии икры закладывали в отдельные маркированные ячейки аппарата "Осетр" для дальнейшей инкубации. Во время инкубации через каждые 12 часов осуществляли контроль за гидрохимическим состоянием воды.
На развивающейся икре севрюги после обесклеивания проводили многофакторный эксперимент» где кратковременное воздействие каждого из неблагоприятных факторов (повышенной температуры, солености, дефицита
кислорода) трижды в период эмбриогенеза сочеталось с обработкой каждым из БАВ. что давало возможность изучать роль БАВ как протекторов развития зародышей в экстремальных условиях. Для каждой партии икры в дальнейшем определяли процент живых эмбрионов незадолго до выклева, в том числе, зародышей находящихся на разных стадиях эмбриогенеза, и процент особей, имеющих наиболее типичные дефекты развития.
Методика проведения производственной проверки
В режиме производственной проверки было испытано лишь одно биологически активное вещество - эпибрассинолид в виде препарата "эпин". показавшее наилучшие результаты в предварительных экспериментальных работах.
На Лебяжьем ОРЗ были проинъецированы 24 самки русского осетра. Пригодную для оплодотворения икру дали 20 самок. Икру от каждой самки в зависимости от ее веса делили на два или три таза. Один из тазов служил опытом, т.е. при осеменении и обесклеивании икры в него добавляли эпин до концентрации 10"4 мг/л по эпибрассинолиду. Еще один или два таза служили контролем и проходили процедуру осеменения и обескле-ивания согласно стандартной технологии. Икру, обработанную эпином, закладывали в ячейки аппаратов "Осетр" в левой части цеха, а контрольную икру - в правой части цеха для того, чтобы обеспечить скат выклюнувшейся опытной и контрольной личинки по разным желобам в разные накопительные емкости с целью дальнейшего просчета. Определение процента эплодотворения икры было проведено на стадии желточной пробки. В каждой опытной и контрольной ячейке количество живой и мертвой икры просчитывали трижды. Количество однодневной личинки оределяли весовым методом и рассаживали по 80 тыс. шт. в пластиковые бассейны. Всего конт-эольной личинкой было зарыблено 16.5 бассейна (1320000 шт.). опытной -[4.5 бассейна (1160000 шт.). Ежедневно чистили опытные и контрольные эассейны, собирали и поштучно пересчитывали отход, в случае необходи-«эсти (большое количество отхода) меняли воду.
Готовых к переходу на активное питание личинок пересаживали в фуды. Перед пересадкой было проведено взвешивание всех личинок в трех сонтрольных и трех опытных бассейнах. . Одновременно были взяты пробы шчинок из нескольких контрольных и опытных бассейнов для оценки их :реднего веса на момент зарыбления.
Всего контрольними и опытными личинками было зарыблено 6 прудов: ри опытных и три контрольных. Все 6 экспериментальных прудов были асположены рядом, имели одинаковую глубину и площадь (2.2 га), были алиты одновременно и имели сходный гидрохимический режим. В каждый из рудов было посажено 266 тыс. шт. опытных или контрольных личинок. Ос-
тавшиеся личинки были смешаны и выращивались в других прудах ЛОРЗ. не участвующих в эксперименте. Через 34 дня после зарыбления была проведена бонитировка экспериментальных и контрольных,прудов - траление, подсчет молоди в трале, отбор выборок для контрольного взвешивания.
Метод оценки влияния различных концентраций эпина на подвижность спермы осетровых рыб
Для определения активности различных препаратов эпина был разработан экспресс-метод основанный на оценке времени подвижности сперматозоидов осетровых при активации чистой водой и растворами этого вещества. Эксперименты выполнены на иативной сперме от 16 самцов белуги. 12 - русского осетра и 9 - севрюги. 12 криоконсервированных образцах спермы белуги. В работе использовали три разных образца препарата "Эпин": N 1 - образец 1995 г.. на котором были получены основные экспериментальные результаты; N 2 - образец 1996 г.. использованный при проведении производственной проверки, и N 3 - образец 1997 г.. при изготовлении которого была достигнута еще более высокая степень очистки от ингибирующих действие фитогормона стереоизомеров.
Для удобства, быстроты и эффективности просмотра сразу нескольких опытных вариантов и контроля, чашку Петри делили стеклографом на 8-12 секторов. В каждый сектор при микродозатором вносили каплю активирующей среды объемом 0.1 мл: чистую воду (контроль. 1-2 повтора) и сравниваемые партии "Эпина" в четных концентрацях: 10м , 10"8. 10~6. 10"4 и 10"z мг/л по эпибрассинолиду. Затем быстро (в течение 10 с) в каждую из капель скальпелем вносили небольшое количество спермы, так что активация спермы в каждой капле происходила практически одновременно. В то же время запускали секундомер, после чего сперму в каждой капле размешивали скальпелем и помещали чашку Петри на предметный столик микроскопа "Виолам" так, что при ее повороте на 1 сектор под объективом каждый раз оказывалась следующая капля. Чашку Петри поворачивали под микроскопом по часовой стрелке, просматривали состояние спермы в каждой капле с интервалами около 1 мин (по 6-Ю с на каждую попадающую под объектив каплю) и фиксировали по секундомеру время полной остановки всех сперматозоидов в том или ином растворе. Каждый такой опыт повторяли трижды с постоянным учетом температуры растворов.
Для более эффективного и быстрого проведения подобной работы в заводских условиях, нами было предложено устройство для одновременного тестирования подвижности спермы (ОТПС). заменяющее чашку Петри.
Методика проведения заключительной производственной проверки Вторая производственная проверка была проведена в течение рыбоводного сезона 1998 на Лебяжьем и Кизанском осетровых рыбоводных заводах. В данной работе нами использованы только материалы, полученные лично нами на русском осетре. В этих экспериментах, в отличие от предыдущей проверки, был использован спиртовой раствор эпибрассинолида в концентрации 10"7 мг/л, предварительно подобранной именно для этого препарата на сперме того же вида. В остальном методика постановки производственных экспериментов не отличается от таковой 1996 г.
Полученные экспериментальные данные были подвегнуты статистической обработке на персональном компьютере в специально составленных для этих целей программах по стандартным формулам Шлохинский, 1985).