Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Литературный обзор 9
1.1 Равновесие тиол-дисульфид 9
1.2 Монооксид азота 10
1.3 S-нитрозотиолы 12
1.4 Тиолат-содержащие координационные соединения железа 16
1.5 Взаимодействие железосерных кластеров с монооксидом азота 22
1.6 Взаимодействие растворов солей железа(II) с монооксидом азота 23
1.7 Нитрозильные координационные соединения железа
1.7.1 Железо-мононитрозильные комплексы 34
1.7.2 Динитрозильные комплексы 38
1.8 Заключение 50
ГЛАВА 2. Экспериментальная часть 51
2.1 Реактивы и инструментальные методы анализа 51
2.2 Методика проведения ВЭЖХ эксперимента 52
2.3 Молекулярное моделирование 53
2.4 Методики синтеза
2.4.1 Синтез биядерных нитрозильных комплексов железа 53
2.4.2 Получение S-нитрозотиолов 65
ГЛАВА 3. Результаты и их обсуждение 69
3.1 Синтез биядерных динитрозильных комплексов железа 69
3.2 Конкурентные реакции нитрозилирования 72
3.3 Строение биядерных динитрозильных комплексов железа 74
3.4 Влияние заместителей на электронное строение остова ДНКЖ 82
3.5 Возможные пути формирования биядерных динитрозильных комплексов железа в растворах ROH 84
3.6 Способность нитрозильных комплексов железа к селективному окислению тиолов 89
Заключение 95
Список литературы 97
- Монооксид азота
- Взаимодействие растворов солей железа(II) с монооксидом азота
- Методика проведения ВЭЖХ эксперимента
- Конкурентные реакции нитрозилирования
Введение к работе
Актуальность
Сера цистеиновых остатков белков в комбинации с ионами биологически значимых d-элементов участвует в реакциях переноса электронов, чем обеспечивает протекание большинства процессов жизнедеятельности организма. Одним из важнейших окислительно-восстановительных процессов с участием тиольной серы является так называемый «тиол-дисульфидный статус» организма. К настоящему времени установлено, что этот статус является ключевым фактором многих клеточных сигнальных каскадов, а также процессов метаболизма и поддержания гомеостаза. Сущность этого статуса заключается в обратимых переходах тиолов в их окисленную дисульфидную форму 2RSH - 2e (RS)2+ 2H+. Основным фактором, приводящим к нарушению тиол-дисульфидного статуса, являются активные формы кислорода, взаимодействие с которыми приводит к переокислению тиолов. С другой стороны, взаимодействие монооксида азота, относящегося к активным формам азота, приводит к формированию нестабильных S-нитрозоформ тиолов RSNO, разлагающихся с образованием дисульфидов (RS)2. Актуальной задачей, стоящей перед прикладной координационной химией, является разработка методов селективного влияния на тиол-дисульфидный статус без формирования переокисленных SH-групп цистеинов до соответствующих сульфиновых (RSO2H) и сульфокислот (RSO3H).
В настоящей работе исследован вопрос возможности участия биядерных тио-латмостиковых динитрозильных комплексов железа (ДНКЖ) в реакциях селективного окисления биотиолов до их дисульфидных форм.
Степень разработанности
На сегодняшний день не ясно, можно ли селективно S-нитрозилировать био-тиолы при помощи нитрозильных комплексов железа и тем самым косвенно влиять на равновесие тиол-дисульфид. Для изучения процесса S-нитрозилирования необходимо разработать методику, позволяющую удобным способом регистрировать продукты реакции ДНКЖ с биотиолами. Варьируя заместитель при мостико-вой сере, можно оказывать влияние на свойства комплексов [Fe2(-SR)2(NO)4], в том числе и на их реакционную способность. Сегодня информация о влиянии заместителя R на стереоэлектронные свойства остова комплексов является не полной и не носит систематического характера, что требует проведение дополнительных исследований. Получение комплексов [Fe2(-SR)2(NO)4] со сложными функциональными заместителями R влечёт за собой необходимость разработки новых эффективных и простых методов их синтеза.
Цель работы состояла поиске новых путей синтеза биядерных тиолат-мостиковых нитрозильных соединений железа общей формулы [Fe2(-SR)2(NO)4] и исследовании способности этих комплексов участвовать в реакциях окисления модельных биотиолов.
4 Задачи исследования включали:
разработку методик синтеза биядерных тиолат мостиковых нитрозо-соединений железа типа [Fe2(-SR)2(NO)4] со следующими мостиковыми лигандами, заметно различающимися стереоэлектронными свойствами: и-PrSH, Ph2CHSH, BnSH, фур-фурил-SH, тиенил-СH2-SH, Ph3CSH, н-C6H13SH, цикло-C6H11SH, AdCH2SH, R-NH-CH2-CH2-SH (R= Ac, Boc), а также получение монокристаллов, пригодных для проведения рентгеноструктурного анализа (РСА);
установление зависимости влияния заместителя R на электронное строение комплексов [Fe2(-SR)2(NO)4] методом рентгенофотоэлеткронной спектроскопии (РФЭС) и квантовохимическими расчётами;
- проведение квантовохимических DFT-расчётов для моделирования возможных
путей формирования комплексов [Fe2(-SR)2(NO)4];
- исследование процесса окисления модельных трипептидов до их дисульфидных
форм в присутствии комплексов [Fe2(-SR)2(NO)4] методом высокоэффективной
жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
Научная новизна
Выделен ряд железо-нитрозильных комплексов общей формулы [Fe2(-SR)2(NO)4], где R = и-PrSH, Ph2CHSH, Ph3CSH, BnSH, фурфурил-SH, тиенил-СH2-SH, н-C6H13SH, цикло-C6H11SH, AdCH2SH, R’-NHCH2CH2-SH (R’ = Ac, Boc). Структуры соединений, содержащих мостиковые группы и-PrS, Ph2CHS, BnS, фурфурил-S, тиенил-СH2-S, н-C6H13S и Ac-NHCH2CH2S, установлены методом РСА, а также выделен и структурно охарактеризован п-монометокситритил-S-нитрозотиол MeOPh3CS-NO.
Показана способность комплексов [Fe2(-SR)2(NO)4] к некаталитическому окислению тиолов до дисульфидной формы за счёт реакции транс-нитрозилирования тиолов.
На основании данных квантовохимических расчётов предложена гипотеза о наиболее вероятном пути формирования [Fe2(-SR)2(NO)4] в водных и спиртовых растворах.
Теоретическая и практическая значимость
Полученные за время выполнения исследований данные вносят теоретический вклад в представления о способах формирования железо-нитрозильных комплексов [Fe2(-SR)2(NO)4], а также структуре и реакционной способности этих соединений.
Практическая значимость исследования состоит в том, что выделенные координационные железо-нитрозильные соединения могут быть предложены для разработки медикобиологических препаратов, оказывающих влияние на тиол-дисульфидный статус организма.
На защиту выносятся следующие положения:
1. методики синтеза биядерных тиолат-мостиковых комплексов железа, содержащих различные тиоловые лиганды;
-
результаты РСА для комплексов [Fe2(-SR)2(NO)4] где -SR: и-PrS, Ph2CHS, BnS, фурфурил-S, тиенил-СH2-S, н-C6H13S, AcNHCH2CH2-S, а также S-нитрозотиолов (MeOPh)Ph2CS-NO;
-
результаты РФЭС и квантовохимических исследований влияния природы заместителя R на электронное строение соединений;
4. результаты ВЭЖХ исследования гомогенного окисления модельных пептидов
(GluCysGly и LycCysGlu) комплексам [Fe2(-SR)2(NO)4] в водной среде.
Методология, методы исследования и использованное оборудование
Диссертационная работа построена по следующему принципу: 1) изучение возможных путей формирования биядерных тиолатмостиковых нитрозильных комплексов железа; 2) разработка новых методов получения этих комплексов; 3) изучение влияния заместителя при мостиковой сере на стереоэлектронное строение комплексов; 4) изучение способности ДНКЖ участвовать в реакциях S-нитрозилирования и окисления биотиолов.
Анализ на содержание Fe в комплексах проводился методом атомно-эмиссионной спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой на приборе Perkin Elmer Optima 7300 DV1). Элементные анализы на содержание углерода, азота и серы проводили с помощью CHNS-анализатора LECO CHNS(O)-932. Электронные спектры поглощения растворов комплексов записывали на спектрофотометре Shimadzu UV-1800 в интервале 190-1100 нм. ИК спектры образцов, таблетированных с KBr, регистрировали в области 5000400 см-1 на ИК Фурье-спектрометре Shimadzu IR-Affinity-1. Рентгеноструктурные исследования проводили на автоматическом ди-фрактометре Bruker Smart APEX II CCD2). РФЭС снимали на электронном спектрометре Perkin-Elmer PHI 5400 при возбуждении рентгеновским излучением Мg3). Спектры нормировали по энергии С1s, принятой 285.0 эВ. За протеканием реакции окисления тиолов следили методом ВЭЖХ на обращеннофазной колонке с помощью хроматографа Shimadzu LC-10AS, снабженного УФ-детектором, работающем на частоте 210 нм. Для исследования электрохимических свойств соединений использовался метод циклической вольтамперометрии на потенциостате ПИ-50.1-1, программатор ПР-8 и 12-разрядный аналого-цифровой преобразователь ЛА-70М4. Спектры 1H ЯМР записывались при комнатной температуре на спектрометре Bruker с частотой 400 МГц со стабилизацией по дейтерию. Химические сдвиги ядер водорода определяли относительно ТМС. Мёссбауэровские спектры записывались на приборе компании Wissel при комнатной температуре в режиме постоянных ускорений с источником 57Со в Rh матрице. Изомерные сдвиги определяли относительно -Fe4). Квантовохимические DFT (B3LYP/cc-PVTZ) расчёты соединений были выполнены с использованием программного комплекса Gaussian 09.
1) Анализ на содержание металла выполнил Вячеславов А.В., СПбГТИ(ТУ).
2) РСА проведен к.г.-м.н. Гуржием В.В. на кафедре кристаллографии СПбГУ.
3) Данные РФЭС получены д.х.н. Щукарев А.В., университет Умео, Швеция.
4) Данные Мёссбауэровской спектроскопии получены к.х.н. Панчуком В.В. СПбГУ.
6 Достоверность полученных результатов
Достоверность работы и обоснованность её выводов подтверждается воспроизводимостью экспериментальных данных и высокой степенью сходимости результатов, полученных с использованием различных современных методов исследования.
Апробация работы
Основные результаты диссертации докладывались на XXV и XXVI Международных Чугаевских конференциях по координационной химии (Суздаль, 2011, Казань 2014); V и VI Всероссийских конференциях студентов и аспирантов (Санкт-Петербург 2011, Санкт-Петербург 2013); «Химическая технология и биотехнология новых материалов и продуктов». IV Международной конференции российского химического общества имени Д.И. Менделеева (Москва, 2012), VII Всероссийской конференции по химии полиядерных соединений и кластеров «Кластер-2012» (Новосибирск 2012), XV молодёжной школе-конференции по органической химии (Уфа 2012).
Работа выполнена при поддержке: Правительства Санкт-Петербурга победителям конкурса грантов для студентов ВУЗов, аспирантов ВУЗов, отраслевых и академических институтов, расположенных на территории СПб; программы Президиума РАН «Фундаментальные науки – медицине» в 2012-2014 гг., а также Правительства России для государственной поддержки научных исследований, проводимых под руководством ведущих учёных в российских ВУЗах (грант № 14.B25.31013).
Публикации
Основное содержание работы отражено в 14 публикациях, в том числе в 7 статьях (из перечня рецензируемых журналов ВАК РФ) и тезисах 7 докладов Международных и Всероссийских конференций.
Объем и структура работы
Монооксид азота
ORTEP представление молекулярной структуры [Fe2(-S)2(SPhMe)4]2- [54] Биядерные мостиковые комплексы [Fe2S2(SAr)4]2- были получены также в работе [55] обменной реакцией между N-координированным индолятными лигандами [Fe2(-S)2(NR)4]2- и ароматическими тиолами: [Fe2(-S)2(indolate)4]2- + 4 MeOPhSH = [Fe2(-S)2(SPhOMe)4]2- + 4 indole Впервые этот метод был опубликован в работе Мейера с сотр. [56], где описано получение подобным способом нескольких тиолатных соединений типа (Et4N)[Fe2S2(SAr)4] из комплексов (Et4N)[Fe2S2(indolate)4] с выходами от 55 до 80%. При взаимодействии FeCl24H2O непосредственно c тиолатами щелочных металлов происходит образование комплексов биядерного мостикового строения [Fe2(-SR)2(SR)4]2-. В случае лиганда 2-пропантиола (iPrSH) его координация в комплекcе осуществляется как в терминальном, так и в мости-ковом положениях [57]: 2FeCl24H2O + 4iPrSH = [Fe2(-SiPr)2(SiPr)4]2- + 4HCl В работе [58] был получен и структурно охарактеризован «смешанный» кристалл [NMe4]2[Fe2(ji-StBu)2(StBu)4], содержащий комплекс в двух различных конформациях (а и р) (рисунок 1.4.5): Рисунок 1.4.5 ORTEP представление молекулярных структур изомеров: А) а-[Fe2(u-SrBu)2(SrBu)4]2- и Б) p-[Fe2(u-SrBu)2(SrBu)4]2- [58] Комплекс получали реакций между растворенным в ДМФА хлоридом желе-за(П), метанольным раствором /?е -бутилтиолата натрия и хлорида тетра-метиламмония: FeCl2 + 6 NaS u + 2 [NMe4]Cl = [NMe4]2[Fe2(u-S/Bu)2(SfBu)4] Комплекс в конформации р (мостиковые тиолаты лежат в плоскости Fe2S2-остова) может быть выделен индивидуально обменной реакцией с N-координированными пиридиновыми лигандами [58]: 2[Fe(C5H5N)4Cl2] + 6 NaS u + 2 [NMe4]Cl = [NMe4]2[Fe2(u-SrBu)2(SrBu)4] + 6NaCl В работе [59] методом Мёссбауревской спектроскопии было показано, что в биядерных комплексах [Fe2( -SEt)2(SEt)4]2" спектр ЯГР состоит из симметричного дуплета с характеристиками AQ = 3.25 mm/s, 5 = 0.7 mm/s, а атомы железа являются эквивалентными и находятся в высокоспиновом состоянии, претерпевая антиферромагнитное спаривание между двумя d-электронами каждого атома, что приводит к уменьшению расстояния DFe-Fe до З А. В комплексе -[Fe2(-StBu)2(StBu)4]2-, возможно, отсутствует спаривание d-электронов ионов железа, что приводит по данным РСА к удлинению расстояния FeFe до 3.701 (рисунок 1.4.5 Б), что по данным DFT расчётов вызывает повышение полной энергии молекулы на 29.4 кДж/моль [58].
Биядерные тиолатмостиковые комплексы железа(II) [Fe2(-SR)2(SR)4]2-могут быть окислены до соответствующего нейтрального комплекса железа(III) [Fe2(-SR)2(SR)4]. Пример образования такого соединения (рисунок 1.4.6) представлен в работе [60], где в качестве окислителя использовалась соль ферроцения FcPF6:
Схематическое представление процесса окисления [Fe2(-SR)2(SR)4]2- [60] Следует отметить, что подобное восстановление не ведёт к внутримолекулярному окислению тиолатных лигандов до дисульфидных форм, как в случае с металлами платиновой группы [3].
Таким образом, на основании представленных работ можно сделать вывод, что взаимодействие тиолатных лигандов с ионами железа (II/III) приводит к образованию стабильных соединений с двумя тиолатными мостиками -SR и не сопровождается окислением этих лигандов до дисульфидной формы (SR)2. 1.5 Взаимодействие железосерных кластеров с монооксидом азота
Известно, что при взаимодействии NO с [xFe-yS]-кластерами происходит формирование нитрозильных комплексов железа (НКЖ) [61,62]. В работе [63] методом ИК спектроскопии показано, что при нитрозилировании [2Fe-2S]-ферредоксина (Fd) происходит формирование динитрозильных комплексов железа (ДНКЖ) моно- и биядерного строения, что фиксировалось по характеристическим колебаниям нитрозильного лиганда при 1815 (моно-) и 1782 (ди-) см-1. Авторы [63] показали, что для протекания реакции необходимо наличие в среде окислителя, например, О2 или йодацетамида IAm. Мо-стиковый сульфид в результате реакции окисляется до элементарной серы. Образование моно- или биядерных комплексов является функцией рН: при физиологическом значении 7.5 идёт преимущественно формирование комплексов биядерного строения [Fe2(-Cys)2(NO)4], а при более низком значении 6.0 – моноядерных комплексов [Fe(Cys)2(NO)2]- [63] (рисунок 1.5.1):
Взаимодействие растворов солей железа(II) с монооксидом азота
Реактивы, полученные из коммерческих источников, использовались без предварительной очистки. Растворители использовались марки хч, поставляемые фирмой ЗАО «Вектон»; соляная кислота, тиосульфат натрия и карбонильное железо также закупались в ЗАО «Вектон». Далее указаны реактивы с кодом поставщика в скобках: реактив Лавессона P4(MeOPh)2S4 (227439 Aldrich), нитрит натрия (237213 Sigma-Aldric), глутатион (12 0050 Acros Or-ganis), 2-фуранметантиол (F20408 Aldrich), 1-гексантиол (234192 Aldrich), 2-тиофенметанол (T32654 Sigma), 2-пропантиол (59590), циклогенсантиол (C105600 Aldrich), тиофенол (240249 Aldrich), бензилтиол (B25401 Aldrich), уксусный ангидрид (149490010 Acros), ди-трет-бутил-карбонат (189771 Acros), цистеамина гидрохлорид (M6500 Sigma), железа пентакарбонил (481718 Aldrich), O,O-диэтилтиофосфат калия (445177 Aldrich), о-фенилендиамин (P23938 Aldrich), тиогликолевая кислота (528056 Aldrich).
Анализ на содержание Fe в комплексах проводился методом атомно-эмиссионной спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой на приборе Per-kin Elmer Optima 7300 DV (Вячеславов А.В., СПбГТИ(ТУ)). Элементные анализы на содержание углерода, азота и серы проводили с помощью CHNS-анализатора LECO CHNS(O)-932. Электронные спектры поглощения растворов комплексов регистрировали на спектрофотометре Shimadzu UV-1800 в интервале 190-1100 нм, используя кварцевые кюветы с l = 1 см. ИК спектры образцов, таблетированных с KBr, регистрировали в области 5 400 см-1 на ИК-Фурье-спектрометре Shimadzu IR-Affinity-1. Рентгенофотоэлектронные спектры (РФЭС) снимали на электронном спектрометре Perkin-Elmer PHI 5400 при возбуждении рентгеновским излучением Al-K (А.В. Щукарев, университет Умео, Швеция). Обработку спектров (количественный анализ и разложение на отдельные линии) проводили по стандартным программам. Спектры нормировали по энергии С1s, принятой 285.0 эВ.
РСА проводили (к.г.-м.н. Гуржий В.В., СПбГУ) на автоматическом ди-фрактометре Agilent Technologies SuperNova Atlas, оснащённом плоским детектором отражённых рентгеновских лучей типа CCD. Измерения проводились при температуре 100 К с использованием микрофокусного монохроматического Cu-K излучения. Структуры уточнялись с использованием программы SHELXL–97 [129], встроенной в комплекс OLEX2 [130]. Поправка на поглощение введена в программном комплексе CrysAlisPro эмпирически с помощью сферических гармоник, реализованных в алгоритме калибрования SCALE3 ABSPACK.
Для исследования электрохимических свойств соединений использовался метод циклической вольтамперометрии на потенциостате ПИ-50.1-1, программатор ПР-8 и 12-разрядный аналого-цифровой преобразователь ЛА-70М4.
Спектры ЯМР записывались при комнатной температуре на спектрометре Bruker-400 с частотой 400 МГц со стабилизацией по дейтерию. Хим. сдвиги ядер водорода определяли относительно Si(Me)4.
Мёссбаэровские спектры (Панчук В.В. СПбГУ) записывались на приборе компании Wissel при комнатной температуре в режиме постоянных ускорений с источником 57Со в Rh матрице. Изомерные сдвиги определяли относительно -Fe.
ВЭЖХ проводили на обращено-фазной колонке с помощью хроматографа Shimadzu LC-10AS, снабжённого УФ-детектором, работающем на частоте 210 нм.
Для исследования способности ДНКЖ участвовать в процессах окисления тиолов использовали модельную реакцию гомогенного перехода RSH в (RS)2. RSH брали в концентрации 6.5ммоль (2 мг/мл). Суммарный объем раствора доводили ацетатным буфером до 20 мл. рН полученного раствора составлял величину 6.0. В полученные растворы добавляли ДНКЖ до концентрации 1.6 ммоль. Реакцию проводили в аэробных условиях. Растворы термостатировали при 25 С. Отсчёт времени начинали с момента внесения в реакционную систему аликвоты ДНКЖ. Регистрацию проводили при длине волны 210 нм, спустя 2.5 ч после начала реакции.
ВЭЖХ эксперимент проводили в условиях термостатирования при 45 С, в качестве элюента использовали водный раствор 2.0% CH3CN, 0.1% три-фторуксусной кислоты и 0.05M (NH4)2SO4. В качестве носителя для разделения использовали обращённую фазу на колонке SupelcoSil LC-18 5 м, 25 см4.6 мм.
Квантовохимические расчёты Расчёты геометрической и электронной структуры, а также анализ нормальных колебаний соединений были выполнены с использованием программного комплекса Gaussian 09 [131]. Для расчёта комплексов железа использовали DFT метод и обменно-корреляционный функционал B3LYP; базис cc-PVTZ [132], эффект сольватации учитывали в модели PCM [133].
Методика проведения ВЭЖХ эксперимента
Графическое представление DFT оптимизированных структур: а) [Fe(H20)4(-OH)2Fe(H20)4]2+ и б) [Fe(MeOH)4(-OMe)2Fe(MeOH)4]2+ Возможность образования алкоголятных комплексов находит и экспериментальное подтверждение. Так методом РСА охарактеризованы комплексы содержащие различные алкоголятные мостиковые лиганды: -ОМе [151], -OEt [152], -ОТг [153], -ОТЗи [154].
Согласно данным квантовохимических расчётов, замена гидроксо-мостиков на алкоголятные приводит к уменьшению расстояния FeFe от 3.08 до 2.60 , что может косвенно свидетельствовать о большей стабильности образующегося в спиртовой среде комплекса. Уменьшение расстояния FeFe увеличивает вероятность внутримолекулярного антиферромагнитного спаривания d-электронов атомов металла, которое может происходить непосредственно между двумя атомами железа или через мостиковый лиганд.
Взаимодействие с тиолами сопровождается реакцией нуклеофильного замещения -OR лиганда на тиолатный: [Fen2(-OR)2(ROH)8]2+ +2 RSH [Fen2(-SR)2(ROH)8]2+ + 2 ROH (4) DFT оптимизированные структуры комплексов после замещения -OR мостиков на тиолатные -SR представлены на рисунке 3.5.3: Рисунок 3.5.3 Графическое представление DFT оптимизированных структур: а) [Fe(H20)4(-SMe)2Fe(H20)4]2+ и б) [Fe(MeOH)4(-SMe)2Fe(MeOH)4]2+
Замещение -ОН на -SR мостики приводит к значительному уменьшению (приблизительно на 0.52 ) межатомного расстояния FeFe. Сокращение расстояния FeFe, вероятнее всего, связано с тем, что RS- лиганды являясь мягкими основаниями Льюиса [155] в отличие от НО- анионов, и в большей степени стабилизирует низкую степень окисления железа. Следует отметить, что, судя по увеличению расстояния между атомом железа и одним координированным лигандом, нуклеофильное замещение приводит к понижению координационного числа металла до 5, что является нехарактерным для ионов железа. Предположительно, образование несимметричного би-ядерного комплекса с «вакантным» координационным положением может способствовать присоединению молекулы NO и формированию ДНКЖ.
С учётом описанных выше процессов гидролиза и реакции нуклеофиль-ного замещения -OR лиганда на тиолатный формирование соединений [Fe2(-SR)2(NO)4] может быть полностью представлено последовательностью реакций (1)-(7).
Присоединение двух молекул монооксида азота (так называемая «brown ring» реакция [97]) к биядерному координационному остову [Fen2(-SR)2]2+ обусловлено образованием двух ковалентных связей за счёт неспаренных тг-электронов молекул NO и 3ё-электронов ионов Fen Молекулы NO в результате образования такой связи могут восстановиться до нитроксильных10) лигандов NO- [156-158], а ионы FeII в комплексе окислиться до FeIII. Таким образом образуется промежуточный мононитрозильный комплекс: [FeII2(-SR)2]2+ + 2NO [FeIII2(-SR)2(NO)2]2+ (5) Существование NO группы в виде аниона в составе комплексов железа подтверждается и экспериментальными работами. Так, например, в работе [159] методом спектроскопии 17О ЯМР показано, что координированная NO группа в [Fe(CN)5NO]2- способна присоединять протон с формированием комплекса [Fe(CN)5HNO]3- (период полураспада для данного комплекса составляет несколько часов, а константа кислотной диссоциации рКа 11), что свидетельствует об наличие отрицательного заряда на нитрозильном лиганде.
Далее железо(III) вступает в RedOx реакции с тиолами [161], сопровождающиеся восстановлением иона металла и переходом тиола в дисульфид-ную форму (RS)2: [FeIII2(-SR)2(NO)2]2+ + 2 RS- [FeII2(-SR)2(NO)2] + (RS)2 (6) Образующийся комплекс с остовом [FeII2(-SR)2(NO)2] способен к присоединению ещё двух молекул NO, также окисляющих ионы металла до FeIII и, в свою очередь, восстанавливающихся до нитроксильных лигандов NO-. При этом формируется диамагнитный нитрозильный комплекс - так называемый эфир красной соли Руссена (рисунок 3.5.4): [FeII2(-SR)2(NO)2] + 2NO [FeIII2(-SR)2(NO)4] (7) 10) Нитроксильный анион может находиться в двух спиновых состояниях, однако расчётные значения полных энергий NO частиц в различных спиновых состояниях показывают, что триплетное состояние является основным для нитроксильного аниона [160]. Графическое представление DFT оптимизированной молекулярной структуры комплекса [Fe2(-SMe)2(NO)4] Ключевыми в формирования биядерных ДНКЖ в предложенном пути являются RedOx процессы внутримолекулярного окисления ионов железа и координированных лигандов. Диамагнетизм соединения [Fein2(-SR)2(NO)4] объясняется спариванием четырёх пар 3d5 электронов двух ионов Feni с четырьмя парами л-электронов нитроксильных лигандов NO-, а также отмеченным выше дополнительным внутримолекулярным антиферромагнитным спариванием FeFe. На основании предложенной схемы ион железа в составе комплекса [Fe2(-SR)2(NO)4] рассматривается как имеющий формальную степень окисления Fem. Основание полагать, что монооксид азота находится в восстановленном состоянии находит подтверждение в последних работах группы Лиау [15,162-164].
Как было отмечено в литературном обзоре, ДНКЖ при растворении в водных растворах способны к гидролизу, сопровождающемуся выделением NO (см. приложение Е), который может участвовать в реакциях «переноса» нитрозофункции (реакция транс-нитрозилирования) на тиолы с образованием нитрозопродуктов RSNO. S-нитрозотиолы являются, как правило, нестабильными соединениями, и разлагаются с образованием дисульфидной формы (RS)2:
Конкурентные реакции нитрозилирования
Таким образом, ДНКЖ могут оказывать влияние на тиол-дисульфидный статус через образование промежуточных S-нитрозосоединений. Можно предположить, что окисление тиолов протекать по несвязанному с нитрозилиро-ванием пути, а происходит в результате RedOx реакции переноса электрона от RSH к ДНКЖ.
В качестве модельных соединений для изучения окислительно-восстановительных свойств ДНКЖ были выбраны комплексы I и II. Экспериментальные данные показали, что нитрозильные комплексы претерпевают основной квазиобратимый одноэлектронный переход с потенциалом полуволны E1/2 –0.89 В (Ep 115 мВ) для соединения I и –1.15 В (Ep 255 мВ) для II относительно E1/2(Fc+/Fc). Значения потенциалов RedOx переходов ДНКЖ не позволяют протекать реакциям окисления глутатиона ECG комплексами за счёт реакции переноса электрона.
Основываясь на предположении, что ДНКЖ типа [Fe2(-SR)2(NO)4] могут оказывать влияние на тиол-дисульфидный статус за счёт реакции S-нитрозилирования, в настоящей работе методом ВЭЖХ были исследованы продукты взаимодействия тиолов с ДНКЖ. В качестве источников NO были выбраны водорастворимые ДНКЖ катионного [Fe2(-SCH2CH2NH3)2(NO)4]+ и анионного [Fe2(-SSO3)2(NO)4]- типов [107,121,122,165]. Содержащие цисте-ин водорастворимые трипептиды GluCysGly (глутатион, ECG) и LysCysGlu (KCE) использовались как модельные тиолы.
Для того, чтобы фиксировать процесс нитрозилирования и образования дисульфидных форм пептидов, были получены стандартными синтетическими подходами и исследованы методом ВЭЖХ контрольные образцы нитрозили-рованных и окисленных пептидов. На рисунке 3.6.1 (A, B) представлены хро-матограммы исходных ECG, KCE и дисульфидных форм пептидов (ECG)2 и (KCE)2, а на рисунке 3.6.1 (C, D) – нитрозилированных тиолов EC(NO)G и KC(NO)E:
Рисунок 3.6.1 Хроматограммы пептидных образцов: а) глутатион ECG и его дисульфидная форма (ECG)2, б) пептид KCE и дисульфид (KCE)2, в) S-нитрозоглутатион EC(NO)G, г) S-нитрозопептид KC(NO)E На хроматограммах а-б рисунка 10 видно два основных сигнала, соответствующих восстановленной (пик 1) и окисленной (пик 2) формам трипепти-дов. Как KCE, так и его дисульфидная форма, имеют более короткие времена удержания по сравнению с глутатионом ECG. Тоже самое можно отметить и для нитрозилированных производных пептидов (рисунок 10 в, г).
Нитрозилирование пептидов ECG и KCE комплексами железа, оценивали по появлению характерных полос, соответствующих временам удержания S-нитрозо- дисульфидных форм пептидов, образующихся в результате реакций (1-4):
Катионный ДНКЖ с цистеаминовым лигандом приводит к эффективному нитрозилированию пептидов KСE и ECG, что можно наблюдать по появлению на 6 минуте пика, соответствующего нитрозоформе KC(NO)E. В случае комплекса с тиосульфатными мостиковыми лигандами нитрозилирование идёт в меньшей степени, что, скорее всего, может быть связано с непосредственным взаимодействием пептида с комплексом [Fe2(-SSO3)2(NO)4]2-. Так, из литературы известно [117], что тиосульфатные мостиковые лиганды склонны к замещению на другие тиолатные лиганды, что лежит в основе одной из известных методик получения ДНКЖ [Fe2(-SR)2(NO)4].
Из рисунка 3.6.2 также видно, что более длительное накопление дисуль-фидной формы (KCE)2 (пик 2) может указывать на то, что KC(NO)E является более стабильным S-нитрозопроизводным (пик 3), чем нитрозоглутатион GC(NO)E. Для оценки стабильности соединения KC(NO)E был использован метод УФ-спектроскопии. Нитрозилированные тиолы обладают характери стической полосой поглощения с максимумом при 335 нм, что связано с наличием хромофорных свойств частично носящей двойной характер связи S-N [166]. На рисунке 3.6.3 показана зависимость значения показателя поглощения хромофорной нитрозогруппы KC(NO)E от времени:
УФ-спектры KC(NO)E в водном растворе через различные промежутки времени Из представленных спектральных данных видно, что KC(NO)E полностью разлагается в водном растворе лишь спустя 120 часов, что даёт основание считать его высокостабильным S-нитрозотиолом по сравнению с нитрозоглу-татионом EC(NO)G, разлагающимся полностью за несколько часов [167].
Рассчитанная энергия связи S-N для KC(NO)E в водном растворе составила 125.9 кДж/моль (в приближении гомолитического разрыва связи), что превышает энергию связи S-N для EC(NO)G на 12.2 кДж/моль (приложение Д). Разница в энергии относительно невелика и вряд ли может быть причиной повышенной стабильности. Возможной причиной, устойчивости является структурная особенность трипептида, имеющего циклическую структуру за счёт образования сильной водородной связи между аминогруппой лизина и карбоксильной группой глутаминовой кислоты (рисунок 3.6.4):