Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современные методы лечения травмы спинного мозга (обзор литературы) 13
1.1. Актуальность темы .13
1.2. Патогенез травмы спинного мозга 14
1.3. Доступные методы лечения травмы спинного мозга 16
1.4. Место регенеративной медицины в лечении травмы спинного мозга .19
1.4.1. Подавление ингибиторов роста аксонов и нейротрофические факторы .20
1.4.2. Клеточная терапия 22
1.5. Применение клеток пуповинной крови человека (КПКЧ). 28
1.5.1. Преимущества клеток пуповинной крови 28
1.5.2. Состав пуповинно-плацентарной крови человека .31
1.5.3. Применение клеток пуповинной крови человека при травме спинного мозга 33
Глава 2. Материалы и методы исследования 42
2.1. Состав экспериментальных групп 42
2.2. Модель ушиба спинного мозга у животных (крысы) 44
2.3. Получение, обработка и введение концентрата клеток пуповинно-плацентарной крови человека животным моделям 48
2.4. Оценка двигательной активности задних конечностей животных в открытом поле 53
2.5. Методы оценки двигательной активности задних конечностей у животных с применением нагрузочных тестов 60
2.5.1. Плавательный тест 60
2.5.2. Вращающийся барабан Ротарод 63
2.5.3. Тест с сужающейся дорожкой 64
2.6. Гистологический анализ 66
2.7. Статистический анализ 66
Глава 3. Результаты исследования .68
3.1. Оценка безопасности клеточной терапии 68
3.2. Оценка эффективности клеточной терапии у животных с ушибами спинного мозга тяжелой степени в открытом поле .68
3.3. Применение нагрузочных тестов Ротарод и «Сужающаяся дорожка» 75
3.4. Оценка дисперсии угла сгибания в суставах задних конечностей в плавательном тесте 76
3.5. Сравнение эффективности внутривенного и внутриспинального проведения клеточной терапии у животных с ушибами спинного мозга 85
3.6. Гистологический анализ структуры повреждения спинного мозга 89
Глава 4. Обсуждение результатов 92
Заключение 107
Выводы .111
Список литературы .113
- Клеточная терапия
- Применение клеток пуповинной крови человека при травме спинного мозга
- Оценка эффективности клеточной терапии у животных с ушибами спинного мозга тяжелой степени в открытом поле
- Гистологический анализ структуры повреждения спинного мозга
Клеточная терапия
На сегодняшний день считается, что различные стволовые и прогениторные клетки организма обладают несколькими механизмами регенеративного и репаративного действия: (1) паракринная активность, обусловленная секрецией различных трофических и протективных факторов, способствующих выживанию клеток и волокон, их регенерации и репарации; (2) стимуляция активности эндогенных стволовых и прогениторных клеток организма (в случае ЦНС речь идет об эндогенных тканеспецифичных нейрональных стволовых клетках); (3) прямое регенеративное и репаративное действие, обеспечиваемое воздействием стволовых клеток на поврежденные структуры (например, прямое подавление апоптоза или воздействие на внутриклеточную теломеразу); (4) противовоспалительное действие (предотвращение инфильтрации поврежденныхтканей иммунными клетками, подавление высвобождения провоспалительных цитокинов); (5) ангиогенный эффект (стимуляция пролиферации клеток эндотелия, формирования новых сосудов микроциркуляторного русла и оптимизация кровообращения в области повреждения); (6) прямая дифференцировка в клеточные элементы поврежденной ткани [113, 132, 191]. Описанные механизмы воздействия свойственны всем типам стволовых клеток организма, однако у каждого вида клеток те или иные свойства преобладают. Если говорить прицельно о повреждениях ЦНС, то на сегодняшний день в различных исследованиях применяли все известные виды стволовых и прогениторных клеток – эмбриональные, нейрональные, мезенхимальные, гемопоэтические стволовые клетки, клетки ольфакторного эпителия, шванновские клетки, индуцированные плюрипотентные клетки и клетки пуповинно-плацентарной крови.
Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) человека являются плюрипотентными стволовыми клетками внутренней выстилки ранней бластоцисты. ЭСК способны активно делиться в течение продолжительного времени и дифференцироваться практически в любые типы клеток организма, в том числе нейроны и клетки глии [41]. Многие авторы, такие как Erceg et al. (2007), Gil et al. (2009), Liu et al. (2000), Nistor et al. (2011) и другие, в экспериментальных и доклинических исследованиях описали дифференцировку ЭСК человека в нейрональные клетки-предшественники и нейроны, а также глиальные клетки-предшественники [76, 119, 124]. На животных моделях ушиба спинного мозга было также показано, что введенные эмбриональные клетки выживают в течение длительного времени, сохраняются в беломи сером веществе спинного мозга, дифференцируются и формируют миелинизированные аксоны и, в конечном счете, способствуют восстановлению двигательной и чувствительной функций задних конечностей [97].
Из описанных выше механизмов воздействия эмбриональным клеткам свойственны, по сути, все механизмы. Среди всех видов стволовых клеток ЭСК обладают наиболее активным потенциалом к дифференцировке. Кроме того, уровень секреции трофических и протективных факторов у них существенно выше такового других клеток. Тем не менее, в настоящее время применение любых клеток эмбрионального происхождения в эксперименте, а тем более в клинической практике, в значительной степени ограничено. Это связано, в
первую очередь, с вопросами безопасности применения ЭСК. На сегодняшний день безопасность применения ЭСК полностью не доказана ни в одном исследовании [112, 169]. Основной опасностью является нестабильность генома эмбриональных клеток и высокий риск превращения в раковые клетки, то есть развитие тератом [112]. Это связано с высоким потенциалом ЭСК к делению и дифференцировке. Эти процессы с трудом поддаются контролю, а цена ошибки в данном случае велика – вероятность развития злокачественных новообразований, что для пациента является одним из наиболее опасных осложнений. Поэтому эмбриональные клетки пока недоступны для клинической медицины [26, 35].
Применение ЭСК также ограничено по этическим соображениям. На сегодняшний день их можно получить исключительно из абортивного материала либо из искусственно выращенных зародышей. Сегодня оба метода считаются этически некорректными [107, 183]. Еще одной проблемой в применении эмбриональных клеток является необходимость их культивирования. Учитывая небольшое число клеток, выделяемое из эмбриона, неизбежна необходимость в их культивировании, что является большой проблемой для клиницистов: за редким исключением культивирование клеток требует применения сред животного происхождения, что недопустимо для клинической медицины [104, 130]. Наконец, применение нескольких линий ЭСК, то есть создание химерной популяции клеток, в значительной степени повышает вероятность малигнизации клеточного трансплантата и развития опухолей [26]. Таким образом, вопрос о возможности применения эмбриональных стволовых клеток в клинической медицине остается открытым и требует большого количества новых исследований.
Одним из путей решения этических проблем при использовании эмбриональных стволовых клеток является создание индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs, induced pluripotent stem cells), впервые разработанных в 2006 году группой Takahashi и Yamanaka (2006) [175]. В большинстве случаев их получают из фибробластов кожи с помощью транскрипционных факторов SOX2, OCT4 и KLF4 и протоонкогена c-MYC либо сочетания факторов OCT4, SOX2, Nanog и Lin28. Эти клетки обладают нормальным кариотипом, активно экспрессируют ген теломеразы и соответствуют ЭСК по морфологии, маркерам, пролиферативной активности и дифференцировочному потенциалу. Как и ЭСК, они способны дифференцироваться в любые типы клеток организма, в том числе нейроны, клетки глии и нейрональные стволовые клетки [130, 175, 176].
Однако вторая проблема ЭСК – опасность развития тератом – в случае iPSCs также не решена. В ряде исследований индуцированные клетки показали себя еще более непредсказуемыми в плане пролиферации и развития, что связано с вмешательством в генетический материал соматических клеток для их дедифференцировки [175, 176]. Кроме того, для доставки необходимых транскрипционных факторов в геном клеток используют специальные вирусные векторы, которые, несмотря на высокий уровень безопасности, являются пока непреодолимым препятствием для клиническом медицины. Поэтому применение iPSCs в клинической практике на сегодняшний день не разрешено ни в одной из развитых стран.
Нейрональные стволовые клетки (НСК) являются мультипотентными прогениторными клетками организма, способными дифференцироваться в нейроны, олигодендроциты и астроциты. НСК присутствуют в ЦНС как эмбриона, так и взрослого организма и доступны для выделения и культивирования в виде нейросфер [73]. На сегодняшний день НСК описаны в нескольких структурах головного и спинного мозга – субвентрикулярной зоне латеральных желудочков, зубчатой извилине, гиппокампе, эпендиме центрального канала спинного мозга [73]. В отличие от ЭСК или iPSCs, НСК ограничены в своем потенциале (нейроны/глия), однако возможность дифференцировки в нейроны и клетки глии (в т.ч. в олигодендроциты) НСК подходят для восстановления поврежденной структуры ЦНС. Кроме того, они активно секретируют нейротрофические и нейропротективные факторы, такие как NGF, BDNF, нейтрофины и GDNF [121]. В ряде доклинических исследований было показано, что при трансплантации в ткань спинного мозга НСК сохраняют недифференцированное состояние либо в стандартных условиях дифференцируются в клетки глии [30, 167]. В естественных условиях дифференцировка НСК в нейроны наблюдается крайне редко. При этом направление дифференцировки в значительной степени зависит от структуры микроокружения. При соблюдении ряда условий и стимуляции нейрональной дифференцировки НСК способны in vivo дифференцироваться и в нейроны. Тем не менее, направление дифференцировки НСК не определяет возможности их воздействия на структуру и функции ЦНС. В ряде исследований было показано, что применение НСК при травме спинного мозга способствует восстановлению проводящей функции спинного мозга и двигательной функции конечностей [19, 141, 146, 147]. Сочетание нейрональных клеток-предшественников (NPСs) и глиальных прогениторных клеток (GPСs) позволяет повысить показатель выживаемости введенных клеток, активность дифференцировки в нейроны и олигодендроциты и, в конечном счете, способствует восстановлению функции спинного мозга [108, 129]. Другим способом воздействия на дифференцировку НСК является применение определяющих развитие клеток факторов. При использовании гена костного морфогенного белка (BMP) наблюдается активная дифференцировка НСК в нейроны [164]. Также применение специфических антител, например блокирующих активность цилиарного нейротрофического фактора (CNTF), в значительной степени снижает уровень дифференцировки НСК в астроциты и стимулирует образование нейронов [90]. В целом, в ряде доклинических исследований на моделях травмы спинного мозга у животных применение НСК человека оказалось умеренно эффективным [44, 91, 195].
Применение клеток пуповинной крови человека при травме спинного мозга
На сегодняшний день эффективность применения клеток пуповинно плацентарной крови при травме различных структур ЦНС, в том числе травме спинного мозга, доказана во многих исследованиях. Так Zhao et al. (2004) показали, что эффективность применения клеток пуповинной крови в лечении повреждений нервной системы выше таковой стромальных клеток костного мозга [198]. Авторы сравнивали эффективность локального (внутриспинального) введения CD34+ клеток пуповинной крови и стромальных клеток костного мозга взрослым крысам с травмой спинного мозга. В обеих группах животных, получавших клеточный препарат, наблюдались значительное функциональное улучшение и повышение выживаемости животных по сравнению с контрольной группой. При этом, что интересно, через 7 и 14 дней после трансплантации клеток у животных, получавших CD34+ клетки пуповинной крови, уровень восстановления был выше, чем при введении стромальных клеток костного мозга. Хотя в иммуногистологическом анализе было выявлено, что помеченные бромдезоксиуридином (BrdU) CD34+ КПКЧ и стромальные клетки костного мозга обладали одинаковой выживаемостью и одинаково активно мигрировали в зону повреждения. Некоторые клетки экспрессировали маркеры GFAP и NeuN. Учитывая это, нельзя утверждать, что вся популяция стволовых клеток пуповинной крови подходит для проведения клеточной терапии лучше, чем клетки костного мозга. Однако можно предполагать, что эффективность локального введения CD34+ клеток пуповинной крови в рамках первого этапа клеточной терапии повреждений спинного мозга (аутологичной или аллогенной) выше таковой стромальных клеток костного мозга.
В другой работе Kuh et al. (2005) подтвердили полученные ранее результаты. Так у крыс с травмой спинного мозга при введении клеток пуповинной крови наблюдалось значительное восстановление проводимости через 5 дней после введения по сравнению с контрольной группой. При этом КПКЧ обнаруживались в поврежденных сегментах спинного мозга, тогда как в здоровых участках они отсутствовали [103]. Saporta et al. (2003) также показали, что КПКЧ при введении животным с травмой спинного мозга способны мигрировать в область повреждения из системного кровотока и дифференцироваться в различные клетки нейронального типа, способствуя тем самым регенерации поврежденных аксонов и восстановлению двигательной функции. Авторы вводили внутривенно мононуклеарные клетки пуповинной крови человека крысам с ушибом спинного мозга через 1 или 5 дней после травмы. В ряде функциональных тестов было показано, что введение клеток через 5 дней после нанесения повреждения способствует более существенному восстановлению функции задних конечностей по сравнению с аналогичным введением на 1 сутки и контрольной группой. Что интересно, введенные мононуклеары обнаруживали в дальнейшем в поврежденных сегментах спинного мозга, тогда как в здоровой ткани они отсутствовали [160]. Можно предполагать, что внутривенное введение мононуклеарных клеток пуповинной крови в подострой стадии (5 дней после травмы) является предпочтительным и обеспечивает более высокий уровень функционального восстановления, чем введение тех же клеток в острой стадии (1 день после травмы). Это может быть связано с тем, что большая часть введенных клеток в острейшей стадии травмы спинного мозга может погибать вследствие чрезвычайно активного выброса биологически активных веществ, в том числе провоспалительных цитокинов (так называемый "цитокиновый взрыв", наблюдаемый в зоне повреждения в первые часы и дни после травмы).
Аналогичные результаты были описаны группой Rogers et al. (2003, 2004, 2008). На модели компрессионной травмы спинного мозга авторы показали, что клетки ПК, введенные в раннем периоде после травмы, длительно сохраняются в организме, что свидетельствует о наличии активного нейротрофического действия [157].
В подтверждение предыдущему исследованию Kao et al. (2008) вводили концентрат клеток пуповинной крови человека (в основном гемопоэтические клетки – CD34+) крысам с компрессионной травмой спинного мозга. Исследователи показали, что системное введение КПКЧ способствует значительному улучшению функции задних конечностей, а также уменьшению объема области повреждения вещества спинного мозга и частоты апоптоза поврежденных клеток. При этом после введения CD34+ клеток в ткани спинного мозга авторы отмечали активное накопление факторов GDNF и VEGF. С другой стороны, при введении CD34– клеток ни функциональное восстановление поврежденных сегментов, ни повышение концентрации нейротрофических и ангиогенных факторов не наблюдались [96]. Таким образом, CD34+ клетки пуповинной крови действительно способствуют регенерации тканей спинного мозга, уменьшению объема области повреждения вещества спинного мозга и подавлению апоптоза поврежденных клеток, а также восстановлению двигательной функции задних конечностей у животных с компрессионной моделью травмы спинного мозга, причем действие клеток обусловлено секрецией различных биологически активных факторов, таких как VEGF и GDNF. Кроме того, даже если осложненная позвоночно-спинальная травма не требует хирургической коррекции, системное применение клеток никак не ограничивает их терапевтический потенциал, являясь при этом более простым, легко переносимым и малоинвазивным методом лечения, чем локальное введение клеток.
Еще в одном исследовании Dasari et al. (2007) показали, что локальное введение клеток пуповинной крови в ткань поврежденного спинного мозга через 1 неделю после травмы обеспечивает активную ремиелинизацию поврежденных аксонов [46]. При этом клетки активно дифференцировались в клетки нейронального типа – нейроны, олигодендроциты и астроциты, и обеспечивали формирование нормальных по структуре миелиновых оболочек аксонов в области повреждения. Клетки также секретировали ряд нейротрофических факторов, таких как BDNF, NT3, MBP (основной белок миелина) и PLP (протеолипидный белок), что авторы подтвердили с помощью флуоресцентной гибридизации in situ (FISH). Активная секреция белков MBP и PLP обеспечивает образование миелина и формирование миелиновых оболочек. Авторы также описали восстановление двигательной функции в задних конечностях животных.
В некоторых исследованиях авторы оценивали эффективность применения клеток пуповинной крови в сочетании с различными цитокинами, хотя однонаправленность и сочетаемость их эффектов до сих пор не доказана. Kuh et al. (2005) исследовали применение стволовых клеток пуповинной крови человека и нейротрофического фактора BDNF у животных с травмой спинного мозга [103]. Ранее было доказано, что применение каждого из компонентов терапии по-отдельности – BDNF или клеток пуповинной крови – в острой стадии травматического процесса обеспечивает высокий уровень функционального восстановления и регенерации поврежденных аксонов. В этой работе авторы показали, что уровень восстановления двигательной функции у животных, получавших комбинированную терапию, был выше такового в контрольной группе на каждом этапе исследования при еженедельной оценке результатов. Что особенно интересно, через 8 недель после введения клеток и BDNF в экспериментальной группе наблюдалось более выраженное улучшение показателей двигательных шкал, чем в других группах. По данным иммунофлуоресцентного анализа с использованием антител к BrdU, GFAP и MAP-2 было показано, что введенные клетки пуповинной крови активно дифференцируются в различные клетки нейронального ряда. Это подтверждает предположение о том, что клетки пуповинной крови и фактор BDNF действуют однонаправлено и одинаково стимулируют восстановление поврежденной нервной ткани при повреждении спинного мозга.
Lim et al. (2007) в своей работе оценили эффективность введения мезенхимальных столовых клеток пуповинной крови собаки (МСК-ПК) собакам с травматическим повреждением спинного мозга [115]. Эта работа примечательна тем, что авторы создали, по сути, уникальные условия эксперимента: 1) использование клеток пуповинной крови собаки; 2) применение мезенхимальной фракции клеток; 3) применение комбинированной стратегии лечения. Клетки МСК-ПК собаки вводили непосредственно в зону повреждения спинного мозга. В группе комбинированного лечения животным также вводили рекомбинантный метионилированный гранулоцитарный колониестимулирующий фактор человека (rmhGCSF) подкожно в течение 1 недели после нанесения повреждения.
Оценка эффективности клеточной терапии у животных с ушибами спинного мозга тяжелой степени в открытом поле
В эксперимент по оценке эффективности применения концентрата мононуклеарных клеток пуповинно-плацентарной крови человека у животных с контузионной травмой спинного мозга тяжелой степени было включено 110 животных. Животные были разделены на 3 группы: 1) Крысы с ушибами спинного мозга тяжелой степени, получавшие концентрат клеток пуповинной крови на 1 сутки после нанесения травмы (n = 24); 2) Крысы с ушибами спинного мозга, получавшие концентрат клеток пуповинной крови на 5 сутки после нанесения травмы (n = 32); 3) Крысы с ушибами спинного мозга, получавшие стерильный физиологический раствор в соответствующем объеме -плацебо (контрольная группа, группа самовосстановления) (n = 44).
Кроме того для исключения влияния хирургического вмешательства и применявшегося наркоза была выделена дополнительная контрольная группа ламинэктомии (без нанесения травмы спинного мозга) (n = 10).
После проведения хирургических вмешательств (ламинэктомия Th9 и нанесение контузионной травмы спинного мозга тяжелой степени грузом весом 10 г диаметром 2 мм с высоты 25 мм) животным из 1 группы вводили концентрат мононуклеарных клеток пуповинно-плаценарной крови человека на 1 сутки после травмы. Животным из 2 группы после аналогичных операций клетки вводили на 5 сутки. Животным из 3 группы (контрольной) вместо клеток вводили стерильный физиологический раствор в соответствующем объеме. Животным из 4 группы выполняли только ламинэктомию, однако траму спинного мозга не наносили и лечение не проводили.
Оценку двигательной функции задних конечностей проводили с помощью описанного в Главе 2 метода «открытое поле». Все исследования двигательной функции проводили 1 раз в неделю, начиная с 7 дня после нанесения травмы, в течение 8 недель эксперимента (обсервационный период). В каждой группе вычисляли средние показатели двигательной функции по шкале ВВВ. Данные по каждой группе представлены в Таблице 2 и на Рисунке 7.
В дополнительной контрольной группе (ламинэктомия Th9 без нанесения травмы) в течение всего обсервационного периода (8 недель) результаты оценки двигательной активности стойко соответствовали максимальному показателю в 21 балл по шкале ВВВ. Это соответствует показателю здорового организма и отсутствию какого-либо неврологического дефицита. Таким образом, само хирургическое вмешательство и перенесенный животными наркоз не влияли на результат оценки двигательной функции.
Фотографии животных в процессе исследования двигательной функции в открытом поле представлены на Рисунке 8. Оценку двигательной функции проводили 1 раз в неделю, начиная с 7 дня после нанесения травмы, в течение 8 недель по шкале ВВВ в открытом поле (см. Главу 2). Результаты оценки представлены в виде «средний показатель ± стандартное отклонение».
При анализе данных, представленных в Таблице 2, а также по графику на Рисунке 7 видно, что проведение клеточной терапии способствует более эффективному восстановлению двигательной функции конечностей при анализе в открытом поле. Исходные показатели в трех группах были одинаковыми и составляли 0 баллов по шкале ВВВ, что соответствует параплегии в задних конечностях. Животных, у которых после нанесения травмы сохранялись какие-либо движения в задних конечностях или хвосте, из исследования исключали. В дальнейшем динамика восстановления движений в контрольной и экспериментальных группах различалась. В контрольной группе (СМТ) основной период восстановления составлял 4 недели: за это время максимальный уровень восстановления не превышал 4 баллов по шкале ВВВ. Максимальный показатель, достигаемый животными из контрольной группы за весь период наблюдения (8 недель), составлял 4,7±0,6 баллов, при этом после четвертой недели эксперимента восстановление было минимальным и не превышало 1 балла.
В экспериментальных группах уровень восстановления был достоверно более высоким. Уже к пятой неделе эксперимента у животных из обеих экспериментальных групп наблюдалось восстановления двигательной активности в задних конечностях до 7-8 баллов по шкале ВВВ. При этом динамика восстановления в обеих экспериментальных группах была достоверно лучше, чем в контрольной группе. После пятой недели животные также выходили на фазу «плато», в дальнейшем до конца периода наблюдения восстановление также было минимальным.
К концу обсервационного периода (8 недель) уровень восстановления в обеих экспериментальных группах был достоверно выше, чем в контрольной группе: 7,6 ± 1,1 балл и 7,4 ± 0,4 балла в экспериментальных группах и 4,7 ± 0,6 баллов в контрольной группе, соответственно. При этом уровень достоверности различий был высоким – критерий Ньюмена-Кейлса при сравнении результатов на 3, 5, 6, 7 и 8 неделях эксперимента не превышал 0,022 (P 0,05) – в Таблице 2 и на Рисунке 7 эти показатели отмечены знаком « ». При сравнении данных экспериментальных и контрольной групп разница в уровне двигательной функции составила 16 – 19% по сравнению с нормальным значением (21 балл по шкале ВВВ) и 53 – 62% по сравнению с контрольной группой. Таким образом, проведение клеточной терапии в остром периоде травматического процесса при контузионной травме спинного мозга достоверно способствует восстановлению двигательной функции в конечностях.
При сравнении результатов восстановления между животными из двух экспериментальных групп на протяжении всего периода наблюдения достоверных различий получено не было – в каждом из контрольных исследований в течение 8 недель эксперимента показатели шкалы ВВВ достоверно не различались. Максимальный уровень восстановления животных также был одинаковым (7,6 ± 1,1 и 7,4 ± 0,4 баллов, соответственно), так же как и динамика восстановления. Таким образом, можно предполагать, что сроки проведения клеточной терапии в остром периоде травмы спинного мозга достоверно не влияют на уровень восстановления и конечный исход лечения.
Гистологический анализ структуры повреждения спинного мозга
Основной задачей гистологического анализа была оценка различий в гистологической структуре очага миелопатии в ткани спинного мозга, а также подсчет числа демиелинизированных и ремиелинизированных волокон белого вещества для сравнения групп с клеточной терапией и самовосстановления. С точки зрения данных задач применение толуидинового синего красителя является наиболее оправданным, так как именно эта окраска позволяет оценивать структуру спинного мозга в целом, его отдельных волокон и их миелиновых оболочек (при большем увеличении). Забор образцов проводили по описанному в Главе 2 методу в различные сроки после нанесения травмы – сначала через 1 сутки, в последующем – еженедельно до конца эксперимента (8 недель).
Поперечный срез спинного мозга крысы через 1 сутки после нанесения контузионной ТСМ. Визуализируются множественные очаги гематомиелии в белом и сером веществе спинного мозга (красные стрелки), окруженные зоной перифокального отека (желтые стрелки). Окраска толуидиновым синим. Фиксация четырехокисью осмия. Увеличение х200. На 1 сутки после травмы в структуре спинного мозга визуализировали множественные очаги гематомиелии, как в белом веществе, так и в сером, окруженные зоной перифокального отека (Рис. 13). Достоверных различий в структуре контузионного очага между экспериментальными и контрольными животными выявлено не было. Животных с признаками недостаточного уровня повреждения (очаги гематомиелии малого объема и распространения) в исследовании не учитывали.
В последующем полученные препараты исследовали при увеличении х200, х400 и х1000. Оценивали структуру очага повреждения, в том числе на более поздних стадиях – структуру очага кистозно-глиозно-фиброзной трансформации в зоне повреждения. Учитывая большие размеры очага повреждения по сравнению с полем микроскопа, отсутствие технической возможности точного выполнения серийных срезов и создания трехмерной структуры очага на их основе, сравнение размеров контузионного очага на различных этапах эксперимента по гистологическим срезам оказалось недостоверным, в исследовании эти данные не учитывали. В будущем этой цели в большей степени может соответствовать анализ результатов МРТ исследования, достоверность сравнения которых может оказывается выше.
Также был проведен подсчет числа демиелинизированных и ремиелинизированных волокон белого вещества, однако достоверных различий между различными группами животных также получено не было. Примеры изображений, полученных в исследовании, представлены на Рисунке 14.
Изображение макропрепарата спинного мозга и микрофотографии гистологических препаратов через 6 недель после нанесения травмы. А – макропрепарат спинного мозга с очагом повреждения. Обращает внимание уменьшение толщины спинного мозга на уровне травмы. В структуре спинного мозга имеется хорошо заметная зона посттравматической трансформации (красная стрелка). Б, В – продольный и поперечный срезы спинного мозга. Визуализируется посттравматическая киста, окруженная зоной разрежения продольных волокон спинного мозга. Окраска толуидиновым синим, фиксация четырехокисью осмия. Увеличение х400. Г – Фрагмент белого вещества спинного мозга на уровне травмы. Видны участки нормальных миелиновых оболочек (красные стрелки), перемежающиеся отдельными разрушенными волокнами (желтые стрелки). Утолщенные миелиновые оболочки свидетельствуют о процессе ремиелинизации в данных волокнах (черные стрелки). Окраска толуидиновым синим, фиксация четурехокисью осмия. Увеличение х1000.