Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Современные методы интраоперационной визуализации границ опухолевого роста в хирургии глиом головного мозга 12
1.1. Объем резекции в хирургии глиальных опухолей и его значение 12
1.2 Неоптические методы диагностики 13
1.3 Оптические и спектроскопические методы диагностики в хирургии глиальных опухолей. Оптическая когерентная томография 16
Глава 2 Объекты и методы исследования 35
2.1 Объекты исследования 35
2.1.1 Экспериментальная опухоль головного мозга 35
2.1.2 Материал операционных биопсий 38
2.1.3 Получение изображений методом оптической когерентной томографии в процессе удаления глиальных опухолей 45
2.2 Методы исследования 48
2.2.1 Метод оптической когерентной томографии: получение кросс поляризационных и ангиографических изображений 48
2.2.2 Метод флуоресцентной микроскопии для визуализации микроциркуляторного русла головного мозга и опухоли в эксперименте 55
2.3 Методики исследования 56
2.3.1 Методика in vivo исследования методом оптической когерентной томографии в эксперименте 56
2.3.2 Методика ex vivo исследования методом оптической когерентной томографии в эксперименте и на материале операционных биопсий 58
2.4 Оценка изображений, полученных методом оптической когерентной томографии 60
2.5 Статистическая обработка 70
Глава 3 Анализ изображений нормальной мозговой ткани и опухоли, полученных методом оптической когерентной томографии на модели экспериментальной глиомы 101.8 73
3.1 Сравнительный анализ изображений коры, белого вещества и опухолевой ткани, полученных методом оптической когерентной томографии в эксперименте 73
3.2 Количественный анализ изображений нормальной ткани головного мозга и глиомы 101.8, полученных методом оптической когерентной томографии 85
3.3 Результаты параллельного исследования методами оптической когерентной томографии (режим ангиографии) и флуоресцентной микроскопии микроциркуляторного русла коры головного мозга и глиомы 101.8 87
Глава 4 Анализ изображений, полученных методом оптической когерентной томографии, нормальной мозговой ткани и глиальных опухолей различной степени злокачественности по материалам операционных биопсий 95
4.1 Визуальный анализ изображений коры головного мозга 95
4.2 Визуальный анализ изображений белого вещества 97
4.3 Визуальный анализ изображений глиальных опухолей низкой степени злокачественности (Grade I–II) 99
4.4 Визуальный анализ изображений анапластических астроцитомы и олигодендроглиомы (Grade III), полученных методом оптической когерентной томографии 101
4.5 Анализ изображений глиобластомы (Grade IV), полученных методом оптической когерентной томографии 103
4.6 Критерии визуальной оценки изображений глиальных опухолей и белого вещества, полученных методом оптической когерентной томографии 106
4.6.1 Критерии визуальной оценки изображений белого вещества и глиальных опухолей вне зависимости от степени злокачественности 106
4.6.2 Критерии визуальной оценки изображений глиальных опухолей и белого вещества в группе глиом низкой степени злокачественности (Grade I–II) 110
4.6.3 Критерии визуальной оценки изображений глиальных опухолей и белого вещества в группе глиом высокой степени злокачественности (Grade III–IV) 113
4.6.4 Диагностическая ценность метода по данным визуальной оценки изображений глиальных опухолей и белого вещества 117
4.7 Количественный анализ изображений белого вещества и глиальных опухолей на основании определения коэффициента затухания 121
Глава 5 Интраоперационное применение оптической когерентной томографии в хирургии глиальных опухолей головного мозга 129
5.1 Семиотика изображений коры, белого вещества и опухоли, полученных методом оптической когерентной томографии 129
5.2 Интраоперационная дифференциация опухолевой ткани на основании анализа изображений, полученных методом оптической когерентной томографии 134
5.3. Вариант оптимизации применения эндоскопической оптической когерентной томографии в условиях нейрохирургической операционной 139
Заключение 143
Выводы 147
Практические рекомендации 148
Список используемых сокращений 150
Список использованной литературы 151
- Оптические и спектроскопические методы диагностики в хирургии глиальных опухолей. Оптическая когерентная томография
- Оценка изображений, полученных методом оптической когерентной томографии
- Критерии визуальной оценки изображений белого вещества и глиальных опухолей вне зависимости от степени злокачественности
- Вариант оптимизации применения эндоскопической оптической когерентной томографии в условиях нейрохирургической операционной
Оптические и спектроскопические методы диагностики в хирургии глиальных опухолей. Оптическая когерентная томография
Оптическое излучение может поглощаться, отражаться, рассеиваться, переизлучаться биологической средой с изменением его свойств (рисунок 1). Эти изменения включают изменение интенсивности сигнала вследствие поглощения; изменения в поляризации, когерентности излучения; изменение длины волн вследствие поглощения света флуорофорами или флуоресценции; интерференцию света вследствие несоответствия оптических индексов [154]. Измерение параметров каждого из указанных процессов позволяет получить информацию о микро- и макроструктуре этой среды, движении и форме отдельных ее составляющих.
Спектроскопические методы анализа обладают высокой точностью в детектировании определенных атомов, молекул, химических связей внутри вещества, на основании чего возможна дифференциация различных типов ткани [115, 116].
Методы получения изображений ткани с использованием оптического излучения (методы оптического биоимиджинга) и спектроскопии постепенно переходят из области фундаментальных исследований в клиническую практику. Современные оптические системы обладают следующими преимуществами: неинвазивность и наглядность; широкие возможности для определения уникальных для ткани оптических свойств на основе применения различных вариантов систем по мощности, скорости, интенсивности и другим параметрам используемого оптического излучения [14, 60, 154].
Флуоресцентная диагностика. Наибольшее распространение для определения границ злокачественных глиом в настоящее время получил метод флуоресцентной диагностики, основанный на способности специальных веществ — фотосенсибилизаторов — избирательно накапливаться в опухолевой ткани, в первую очередь вследствие ее повышенной метаболической активности и нарушенного гематоэнцефалического барьера, и при взаимодействии с излучением света определенной длины волны давать свечение (флуоресцировать), что позволяет хирургу визуально определить опухоль и ее границы. Эффективность использования препарата 5-ALA была показана в различных исследованиях, в том числе в III фазе проведенного в Европе многоцентрового рандомизированного контролируемого исследования 270 пациентов [43, 44, 121, 142, 144]. Удельный вес максимальной резекции в исследуемой и контрольной группах составил 65 и 36% соответственно (разность в эффективности — 29%; p 0,0001). Ряд обзорных работ также указывает на эффективность флуоресцентной диагностики в достижении максимального объема резекции [24, 101]. К достоинствам метода стоит отнести возможность одномоментного проведения фотодинамической терапии для удаления остаточной опухоли по границе зоны основной резекции, которая заключается в разрушении структур опухоли вследствие образования свободных радикалов или синглетного кислорода при взаимодействии фотосенсибилизатора с более мощным излучением света [49]. По данным отечественных авторов, чувствительность флуоресцентной навигации с 5-ALA в идентификации глиальных опухолей Grade I–II составляет 58,8%, опухолей Grade III–IV — 89,7% [7]. Однако существует ряд ограничений использования флуоресцентной нейронавигации. Некоторые исследователи [44, 126] указывают на различную степень флуоресценции в зависимости от степени злокачественности опухоли. При этом оценка степени флуоресценции производится хирургом «на глаз» и является субъективной, что может привести к сохранению части опухолевой ткани, обладающей слабой и поэтому незамеченной хирургом флуоресценцией [152].
Методом, который способен идентифицировать небольшие количества фотосенсибилизатора, накопившегося в опухолевых клетках, но недостаточного для индукции видимой флуоресценции, является лазерная и комбинированная спектроскопия [7]. Использование спектроскопии позволило повысить чувствительность и специфичность флуоресцентной диагностики до 88 и 82% соответственно [7]. Поскольку значительным препятствием для количественного определения содержания опухолевых маркеров являются существенные вариации оптических свойств нервной ткани в зависимости от степени ее злокачественности и сопутствующих патофизиологических процессов (отек, гипоксия и другие), был разработан комбинированный метод спектроскопии, учитывающий рассеивающие свойства, кровенаполнение и оксигенацию тканей, что расширяет диагностические возможности метода [7]. Важно подчеркнуть, что размер опухолевой резекции при использовании флуоресцентной диагностики значительно превышает контрастируемый объем опухоли на предоперационных МРТ-изображениях (84 и 39 см3 соответственно; p=0,0087) [135], что необходимо учитывать в ходе предоперационного планирования и при удалении опухолей в функционально значимых областях мозга.
Основным недостатком метода является вариабельность в интенсивности флуоресценции среди злокачественных глиом, которая может быть объяснена наличием различий во внутриклеточном метаболизме препарата и/или его фармакокинетике, обусловленных особенностью функционирования гематоэнцефалического барьера и механизмов клеточного транспорта [37]. Имея высокую степень специфичности, флуоресцентная диагностика обладает недостаточной степенью чувствительности и может давать ложноположительные результаты. Не похоже, что использование флуоресцентной диагностики может привести к гипердиагностике опухоли или гиподиагностике при отсутствии накопления контраста в областях с повышенной плотностью опухолевых клеток [111].
Мультифотонная микроскопия/томография. Методы оптического биоимиджинга, основанные на обнаружении собственных флуорофоров ткани и обладающие пространственным разрешением порядка 1 мкм, такие как конфокальная мультифотонная микроскопия (МФМ) [163] и мультифотонная томография (МФТ) [83], представляют широкий интерес не только в фокусе интраоперационной диагностики границ новообразований, но и в качестве методов оптической цитобиопсии.
Мультифотонная микроскопия, или лазерная сканирующая микроскопия, — современный метод флуоресцентного имиджинга, применимый для прижизненных исследований. В качестве источника возбуждения в данном методе используется фемтосекундный импульсный лазер в инфракрасном диапазоне, что позволяет параллельно реализовывать визуализацию тканей в режиме генерации второй гармоники от анизотропных структур и двухфотонно-возбуждаемой автофлуоресценции с помощью спектрального детектирования сигнала, а также оценивать время жизни этой флуоресценции с помощью режима оценки времени жизни возбужденного состояния флуоресценции (Fluorescence lifetime imaging, FLIM) [81, 105]. Современные технологии сканирования позволяют регистрировать и реконструировать целый набор последовательных, эквидистантных по глубине плоскостей, реализуя тем самым принцип томографической записи (МФТ).
К отличительным особенностям МФТ-подхода для изучения тканей мозга можно отнести принципиальную возможность изучения образцов in vivo (не требуется удаление образца), неинвазивность (за счет использования низкоинтенсивного импульсного инфракрасного лазерного излучения), возможность одновременного мониторинга нескольких параметров и трехмерного отслеживания изменений в режиме реального времени с высоким пространственным разрешением. При этом флуоресценция эндогенных флуорофоров может быть реконструирована в трехмерное распределение без необходимости предварительной подготовки ткани. Для мозговой ткани ранее было показано, что при изучении экспериментальных глиом с помощью двухфотонно-возбуждаемой автофлуоресценции возможно дифференцировать опухолевую паренхиму и неопухолевые клетки перифокальной зоны [84]. Другие исследования методом МФМ в режиме двухфотонно-возбуждаемой автофлуоресценции тканей мозга in vivo показали возможность визуализации сосудистого русла и системы капилляров, а также способность МФТ дифференцировать различные виды нейронов в коре головного мозга [61, 74, 89, 157].
Описываемые методы активно изучаются как потенциальные методы оптической биопсии в хирургии опухолей головного мозга. В работах по применению конфокальной микроскопии [51, 131] было показано, что с помощью эндоскопического варианта конфокального микроскопа удается визуализировать основные диагностические признаки глиобластом: высокую клеточную плотность, участки некроза, фигуры митоза, микроваскулярную пролиферацию. Однако этот метод имеет худшее разрешение и глубину проникновения по сравнению с МФМ/МФТ, так как в нем используется однофотонное возбуждение видимого диапазона, а не двухфотонное излучение инфракрасного диапазона, как в МФМ/МФТ, имеющее бльшую глубину проникновения в биологические ткани. Была показана возможность применения МФМ/МФТ для структурной и фотохимической ex vivo визуализации экспериментальной глиомы и глиальных опухолей человека [81, 83]. Авторы показали возможности метода в визуализации зоны опухоли, границы с нормальной тканью мозга с клеточным разрешением. Объективизировать данные МФМ позволяет количественная оценка плотности клеточных ядер: этот показатель достоверно выше в ткани опухоли по сравнению с нормой [84]. В настоящее время разработан вариант интраоперационного применения МФТ в нейрохирургии [83]. Методы МФМ/МФТ находятся на этапе внедрения в клиническую практику, серьезным ограничением их применения является малая область исследования ткани и относительно большое время сканирования.
Оценка изображений, полученных методом оптической когерентной томографии
Оценка ОКТ-изображений нормальной ткани мозга и глиальных опухолей проводилась путем их сопоставления с соответствующими гистологическими препаратами и известными из литературы сведениями о морфологии [18, 155] и оптических свойствах исследуемых видов тканей [20, 27, 29, 62, 140, 153, 162].
Визуальная оценка ОКТ-изображений. Для описания ОКТ-изображений используются различные характеристики ОКТ-сигнала (см. таблицу 1): степень его интенсивности (яркости), однородности/неоднородности, скорость затухания. С целью выявления наиболее информативных визуальных характеристик ОКТ-изображений для дифференциальной диагностики опухолей головного мозга был составлен тест, включающий 100 ОКТ-изображений: 26 изображений белого вещества и 74 изображения опухолей различной степени злокачественности: Grade II — 12, Grade III — 22, Grade IV — 40. Для данного теста были выбраны ОКТ-изображения, полученные от образцов с типичной морфологической структурой каждого состояния, с отсутствием участков некроза и кровоизлияний больших размеров. ОКТ-изображения с артефактами были исключены. Все изображения были случайным образом перемешаны и пронумерованы.
Создано 2 варианта теста. В первом варианте стандартные ОКТ-изображения, включающие изображения в исходной и ортогональной поляризациях, были разделены на два независимых изображения: в одну папку поместили только изображения в исходной поляризации, в другую — только в ортогональной. Целью данного варианта теста было выявить значимость каждого из предложенных качественных параметров для визуальной оценки изображений в конкретной поляризации по отдельности. Второй вариант теста содержал стандартные ОКТ-изображения — обе поляризации вместе. Данный вариант теста использован для оценки диагностической эффективности ОКТ в определении опухоли любой степени злокачественности среди белого вещества головного мозга.
В тестах участвовали три независимых эксперта, знакомые с методикой ОКТ-исследования и интерпретацией изображений. Каждый тест проводили в два этапа.
На первом этапе теста участникам предлагали наборы обучающих ОКТ-изображений, не использованные в тесте, с подробным описанием каждого оцениваемого параметра (для первого варианта теста) или типа ткани по набору определенных параметров (для второго варианта теста).
Второй этап (собственно слепое распознавание) заключался в присвоении каждому изображению определенной характеристики исходя из задачи теста. У каждой характеристики было только два варианта ответа, которые кодировались как «0» или «1».
В первом варианте теста каждому изображению необходимо было дать характеристику исходя из следующих параметров (рисунок 14):
1. Интенсивность (яркость) сигнала: оценивается средний уровень ОКТ-сигнала. Если средний уровень яркости по информативному (отличному от фона) ОКТ-сигналу оценивается глазом как очень высокий для исходной поляризации (по цвету ближе к белому) или высокий для ортогональной поляризации, изображение классифицируется как интенсивное (рисунок 14, а1, а2, а5, а6), ему присваивается значение «1». Во всех остальных случаях оно классифицируется как неинтенсивное (рисунок 14, аЗ, а4), ему присваивается значение «0».
2. Однородность/неоднородность сигнала: оценивается степень сохранения одинаковой яркости ОКТ-сигнала на изображении. Если на изображении сохраняется примерно одинаковый уровень яркости по поперечной координате, оно классифицируется как однородное (рисунок 14, 61, 62, 65), ему присваивается значение «1». Если на изображении встречаются области с разным уровнем яркости по поперечной координате, оно классифицируется как неоднородное (рисунок 14, 63, 64, 66), ему присваивается значение «0». Для изображений в исходной и ортогональной поляризациях критерии оценки этого параметра одинаковые.
3. Скорость затухания сигнала в ткани оценивается по глубине проникновения зондирующего излучения — расстоянию, которое занимает информативный ОКТ-сигнал по поперечной координате, либо по градиенту (перепаду) яркости с глубиной. ОКТ-сигнал затухает в ткани быстро (присваивается значение «1»), если:
в исходной поляризации высота ОКТ-сигнала составляет меньше или близко к четвертой части от общей высоты изображения либо есть резкое падение яркости сигнала по глубине (от очень высокого до среднего и низкого) (рисунок 14, el);
в ортогональной поляризации высота ОКТ-сигнала составляет меньше или близко к пятой части от общей высоты изображения (рисунок 14, в2, вб) либо есть резкое падение яркости сигнала по глубине (от высокого до среднего и низкого) (см. рисунок 14, в2).
Во всех остальных случаях считается, что ОКТ-сигнал затухает в ткани медленно (присваивается значение «0»), а именно: нет градиента падения яркости сигнала по глубине (рисунок 14, вЗ, в4, в5) или высота ОКТ-сигнала составляет больше четвертой части от общей высоты изображения для исходной поляризации (см. рисунок 14, в3, в5) и больше пятой части изображения для ортогональной поляризации (см. рисунок 14, в4).
В случае наличия областей с разной скоростью затухания сигнала общая оценка скорости сигнала ставится по соотношению размеров этих областей. При приблизительно равных размерах общий сигнал оценивается как медленно затухающий.
4. Равномерность затухания сигнала по глубине вдоль нижней границы изображения: оценивается ровность нижней границы изображения. Если на изображении имеется незначительное колебание контура нижней границы изображения, то сигнал классифицируется как равномерно затухающий (рисунок 14, г1, г2, г6), ему присваивается значение «1». Если на изображении встречаются области с выраженной разницей в скорости затухания сигнала, то сигнал оценивается как неравномерно затухающий (рисунок 14, г3, г4, г5), ему присваивается значение «0». Для изображений в исходной и ортогональной поляризациях критерии оценки этого параметра одинаковые.
Критерии визуальной оценки изображений белого вещества и глиальных опухолей вне зависимости от степени злокачественности
Критерии дифференциальной оценки ОКТ-изображений белого вещества и опухолевой ткани должны удовлетворять следующим условиям:
простота и скорость оценки (критерий сигнала должен быть максимально простым в использовании, легко запоминаться оперирующим хирургом);
информативность (т.е. отражать гистологическую морфологию ткани);
высокая степень межэкспертной надежности (не вызывать существенных разногласий при интерпретации).
С учетом выделения типичных ОКТ-изображений белого вещества и опухолевой ткани для удовлетворения последнего условия были предложены следующие параметры ОКТ-изображений, каждый из которых имеет только два варианта интерпретации (подробно описаны в разделе «Материалы и методы»):
интенсивность (яркость) сигнала — интенсивный/неинтенсивный;
однородность/неоднородность сигнала — однородный/неоднородный;
скорость затухания сигнала в ткани — быстро затухающий/медленно затухающий;
равномерность затухания сигнала по глубине — равномерно затухающий/неравномерно затухающий.
Проведенный «слепой» тест интерпретации заданных критериев тремя независимыми респондентами позволил выявить наиболее значимые характеристики ОКТ-сигнала от опухоли и белого вещества для исходной и ортогональной поляризаций, сформулировать набор основных и дополнительных критериев для визуального определения типа ткани «опухоль /белое вещество».
Для определения связи между параметрами сигнала и морфологией образца. (наличия опухоли или белого вещества) были рассчитаны коэффициенты ассоциации Q и Ф (таблица 8). Наиболее информативными с высокой степенью сопряженности с результатами гистологического исследования и статистически значимыми критериями дифференциальной диагностики являются следующие:
интенсивность сигнала в исходной поляризации [0,91-0,92; 0,64-0,65];
интенсивность сигнала в ортогональной поляризации [0,92-0,94; 0,64-0,70];
однородность/неоднородность сигнала в исходной поляризации [0,86-0,94; 0,47-0,50];
Статистически достоверной, но слабой сопряженностью обладает критерий:
равномерность затухания сигнала по глубине в исходной поляризации [0,58-0,82; 0,3-0,44].
При этом была выявлена высокая степень согласия между респондентами по критериям «интенсивность сигнала» в обеих поляризациях (исходная=0,89, исходная=0,89, ортогональная=0,95, исходная=0,89). По критериям «однородность/неоднородность сигнала» и «равномерность затухания сигнала по глубине» в исходной поляризации согласие оказалось существенным, но не значительным (исходная=0,79, исходная=0,79 и исходная=0,75, исходная=0,75 соответственно).
По критерию «скорость затухания сигнала» степень согласия между экспертами оказалось значимой (исходная=0,68, исходная=0,68), однако по данному критерию не удалось установить достоверной ассоциации с гистологической структурой ткани (таблица 9).
Таким образом, в общем случае (для всех глиом вне зависимости от степени злокачественности) можно выделить два основных критерия дифференциальной диагностики опухоли и белого вещества по краю опухолевой резекции, для которых были выявлены высокая межэкспертная надежность (условие минимальной субъективности) и большая степень ассоциации с гистологической структурой ткани (информативность) (таблица 10).
Также можно выделить дополнительные критерии — «однородность/неоднородность сигнала» в исходной поляризации (высокая информативность, но отсутствует значительная степень согласия) и «равномерность затухания сигнала по глубине» в исходной поляризации (низкая информативность, существенная межэкспертная надежность). Другие указанные критерии носят второстепенный характер, однако при наличии большого опыта у специалиста могут быть приняты во внимание при принятии решения.
Вариант оптимизации применения эндоскопической оптической когерентной томографии в условиях нейрохирургической операционной
Принципиально возможны два решения реализации ОКТ в нейрохирургической операционной: 1) ОКТ в составе операционного микроскопа [98, 99]; 2) ОКТ с зондом для ручного сканирования [71, 97]. В отличие от конфигурации с операционным микроскопом ОКТ с зондом имеет ряд преимуществ: возможность совместного использования с любым микроскопом, не требующего изменения его внутренней схемы; возможность анализа трудно визуализируемых с помощью микроскопа областей операционного поля.
В настоящей работе предложен вариант рационального использования оптического когерентного томоскопа «ОКТ» в условиях нейрохирургической операционной (рисунок 40). Основным недостатком данного варианта ОКТ, на наш взгляд, является необходимость постоянной смены одного из инструментов на ОКТ-зонд. Поэтому нами предложен способ интеграции ОКТ-зонда и отсоса в один инструмент (рисунок 40, д) для возможности одновременного удаления опухоли при помощи биполярной коагуляции и отсоса и анализа морфологической структуры ткани. Для удобства хирурга возможно крепление на башню микроскопа (рисунок 40, а, б) дополнительного монитора, что позволяет хирургу практически не отрываться в ходе оперативного вмешательства от операционного поля для анализа получаемых ОКТ-изображений.
Предложенный комплекс технических решений позволит использовать все преимущества ОКТ с зондом для визуализации границ опухолевого роста при сохранении практически неизменной привычной техники оперативного вмешательства без увеличения времени операции.
Подводя итоги интраоперационного применения ОКТ у пациентов с глиальными опухолями головного мозга можно сделать вывод об универсальности сформулированных ОКТ-критериев для дифференцировки коры, белого вещества и опухолевой ткани вне зависимости от применяемой ОКТ системы. Использование выявленных критериев ОКТ позволяет дифференцировать кору и белого вещество от опухоли и уточнить границы опухолевого процесса как на поверхности коры, так и в белом веществе.
Совместный анализ данных ОКТ, навигационной станции и нейрофизиологического мониторинга позволяет принять решение об объеме резекции в конкретной области.
Перспективы развития метода
Проведенное исследование показывает высокую диагностическую точность метода при использовании критериев визуальной оценки ОКТ-изображений, существенно повысить которую позволяет количественная обработка ОКТ данных с определением коэффициента затухания. В настоящее время такая обработка возможна только при использовании экспериментального прибора.
Внедрение в клиническую практику последних модификаций ОКТ с созданием программного обеспечения с автоматическим определением коэффициентов позволит значительно улучшить визуализацию тканей и даст возможность проводить дифференцировку опухоли и белого вещества с использованием количественных критериев. Кроме того, возможность визуализации микроциркуляторного русла позволит оценивать степень микроваскулярной пролиферации, что может косвенно указывать на степень злокачественности опухоли.
Внедрение ОКТ в хирургию глиом для повышения радикальности проводимых оперативных вмешательств возможно после проведения дополнительных исследований с целью определения алгоритмов верификации границ опухолевого роста с одновременным использованием ОКТ и существующих методов интраоперационной диагностики (флуоресцентная диагностика, нейронавигация, ультразвуковое исследование).
Благодарности
Автор считает своей приятной обязанностью выразить глубокую благодарность научным руководителям д.м.н., профессору Гладковой Наталье Дорофеевне, д.м.н., профессору Кравцу Леониду Яковлевичу за помощь, оказанную на всех этапах выполнения диссертации; к.б.н. Киселевой Елене Борисовне, д.м.н. Загайновой Елене Вадимовне, д.м.н. Клеменовой Ирине Александровне, д.м.н. Карякину Николаю Николаевичу за помощь в подготовке и обсуждении диссертационной работы; д.м.н. Медянику Игорю Александровичу, к.м.н. Балябину Александру Владимировичу, к.м.н. Млявых Сергею Геннадьевичу, к.б.н. Губарьковой Екатерине Владимировне, к.б.н. Карабут Марии Михайловне, к.ф.-м.н. Моисееву Александру Александровичу, к.ф.-м.н. Шилягину Павлу Андреевичу, к.б.н. Халанскому Александру Сергеевичу за помощь в обработке и интерпретации полученных в диссертационной работе данных.