Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Аналитический обзор литературы 14
1.1 Очаговые повреждения головного мозга, патогенез, гистологические изменения в зоне повреждений 14
1.2 Подходы к лечению очаговых ушибов головного мозга 21
1.3 Экспериментальные модели очаговых ушибов головного мозга, критерии тяжести травмы, оценка двигательных и поведенческих нарушений 23
1.4 Стромальные и мезенхимальные клетки, генерируемые из костного мозга и липоаспирата в лечении тяжелых очаговых повреждений головного мозга у экспериментальных животных 32
1.4.1 Регенерация ЦНС как новая цель в лечении тяжелых очаговых повреждений головного мозга 32
1.4.2 Стромальные мезенхимальные клетки, генерируемые из костного мозга и липоаспирата, как будущее клеточной терапии очаговых повреждений головного мозга 33
1.4.3 Механизмы, лежащие в основе эффекта МСК 43
Глава 2. Материалы и методы 46
2.1 Объект исследования 46
2.1.1 Характеристика изучаемых групп 47
2.1.2 Моделирование тяжелого очагового повреждения головного мозга у экспериментальных животных 50
2.2 Оценка повреждений головного мозга, индуцированных очаговым повреждением 54
2.2.1 Оценка неврологического статуса животных 55
2.2.2 Оценка когнитивных функций 57
2.2.3 Оценка статической выносливости 58
2.3 Оценка функционального состояния головного мозга лабораторного животного 59
2.4 Генерация и оценка фенотипических и функциональных свойств мезенхимальных стромальных клеток (МСК) 60
2.4.1 Выделение МСК из костного мозга и жировой ткани (липоаспирата) 60
2.4.2 Определение числа клоногенных предшественников МСК 61
2.4.3 Оценка фенотипа МСК 61
2.4.4 Оценка иммуносупрессорной активности МСК 62
2.4.5 Оценка продукции цитокинов 62
2.5 Характеристика морфологических изменений головного мозга при тяжелом очаговом повреждении 63
2.6 Статистическая обработка экспериментальных данных 64
Глава 3. Результаты собственных экспериментальных исследований 66
3.1 Результаты моделирования очагового повреждения головного мозга 66
3.1.1 Характеристика общего состояния и неврологических нарушений при самопроизвольном восстановлении функций головного мозга животных 66
3.2 Результаты сравнительных характеристик МСК-КМ и МСК-ЛА 74
3.2.1 Сравнительная оценка клоногенности и пролиферативной активности МСК костного мозга и липоаспирата 76
3.2.2 Фенотип МСК костного мозга и липоаспирата 77
3.2.3 Иммуносупрессорная активность МСК костного мозга и липоаспирата 79
3.2.4 Секреторная активность МСК костного мозга и липоаспирата 80
3.3 Влияние МСК, генерированных из костного мозга (МСК-КМ) и липоаспирата (МСК-ЛА), на восстановление моторных и когнитивных функций в модели очагового повреждения головного мозга 84
3.3.1 Эффект трансплантации МСК-КМ и МСК-ЛА на восстановление моторных и когнитивных функций в модели очагового повреждения головного мозга 84
3.4 Исследование эффекта трансплантируемых клеток на динамику электрофизиологической активности мозга в модели тяжелого очагового повреждения 90
3.5 Морфологические изменения после трансплантации МСК в модели тяжелого очагового повреждения мозга 97
3.5.1 Модель очагового повреждения головного мозга (1-е сутки после травмы) 97
3.5.2 Морфологические изменения в модели тяжелого очагового повреждения головного мозга на 7 сутки после травмы без введения клеток 101
3.5.3 Морфологические изменения в модели тяжелого очагового повреждения головного мозга на 14 сутки после травмы без введения клеток 108
3.5.4 Морфологические изменения в модели тяжелого очагового повреждения головного мозга на 21 сутки после травмы без введения клеток 113
3.5.5 Особенности морфологической картины в модели очагового повреждения головного мозга на 7, 14, 21 сутки после трансплантации МСК в 1-е и 7-е сутки после ЧМТ 114
Заключение 122
Выводы 127
Практические рекомендации 129
Список сокращений 130
Список литературы 131
- Экспериментальные модели очаговых ушибов головного мозга, критерии тяжести травмы, оценка двигательных и поведенческих нарушений
- Моделирование тяжелого очагового повреждения головного мозга у экспериментальных животных
- Исследование эффекта трансплантируемых клеток на динамику электрофизиологической активности мозга в модели тяжелого очагового повреждения
- Особенности морфологической картины в модели очагового повреждения головного мозга на 7, 14, 21 сутки после трансплантации МСК в 1-е и 7-е сутки после ЧМТ
Введение к работе
Актуальность исследования. Черепно-мозговая травма (ЧМТ) в на
стоящее время остается актуальной проблемой неотложной нейрохирургии и
важнейшей проблемой здравоохранения и общества в каждой стране (Пу-
рас Ю. В. и др., 2013; Лихтерман Л. Б. и др., 2014; Peeters. W. et al., 2015). Не
удовлетворительные результаты лечения ЧМТ в большей степени связаны с
недостаточным пониманием в области патогенеза тяжелой черепно-мозговой
травмы и отсутствием адекватных экспериментальных моделей для изучения
эффективности новых терапевтических подходов (Белошицкий В. В. И др.,
2005; Ibolja С. et al., 2005; Peeters W. et al., 2015). Большинство эксперимен
тальных моделей ЧМТ имеет неврологический дефицит средней степени тяже
сти (Dixon С. E. et al., 1987, 1988, 2001; Белошицкий В. В. и др., 2005;
Ibolja С. et al., 2005). В то же время именно тяжелая ЧМТ представляет наи
большие проблемы в плане выживаемости и функционального восстановления
пострадавших. Большой интерес в этой области привлекают технологии, осно
ванные на применении стволовых клеток. Большие надежды возлагают на при
менение мезенхимальных cтромальных клеток (МСК) W. et al., 2015;
Hasan A. et al., 2017). МСК способны улучшать неврологические функции за
счет продукции большого спектра трофических и ростовых факторов, которые
активируют нейральных предшественников и ангиогенез,fстимулируют процес
сы нейроплаcтичности и ускоряют проведение нервных импульсов через синап
сы, а также подавляют воспаление и обеспечивают нейропротекцию (Wang S. et
al., 2013; Feigin V.I. et al., 2013). Имеются отдельные экспериментальные и кли
нические работы по использованию МСК в лечении черепно-мозговой травмы,
которые свидетельствуют об эффективности клеточной терапии и открывают
оптимистичные перспективы для ихf клинического использования
(Mahmood A. et al., 2001; Chen X. H. et al., 2003; Южаков В. В. и др., 2007; Harting
M. T. et al., 2009; Григорян А. С. и др., 2010). Однакоfвнедрение результатов
экспериментальныхfисследований МСК в клиническую практикуfосложняется
отсутствиемfадекватных моделей тяжелой ЧМТ у животных, а также рядом не
решенных вопросов относительно оптимальныхfтканевых источников
дляfполучения МСК, сроках и путяхtвведения клеток.
Учитывая принятый в России федеральный закон «О биомедицинских клеточных продуктах; № 180-ФЗ от 23 июня 2016 г.», непременным условием для перехода к клинической апробации является доклиническое тестирование безопасности и эффективности клеток человека (как потенциальных клеточных продуктов) в моделях на животных.
Цель исследования: На разработанной модели тяжелого очагового повреждения головного мозга и на основе клинических, электрофизиологических и морфологических данных изучить влияние мезенхимальных стромальных клеток костного мозга и жировой ткани на эффективность неврологического восстановления экспериментальных животных.
Задачи исследования:
-
Разработать модель травматического очагового повреждения головного мозга со стойким, стабильно воспроизводимым тяжелым неврологическим дефицитом, индуцированным нанесением черепно-мозговой травмы экспериментальному животному через твердую мозговую оболочку, и оценить тяжесть неврологических расстройств, а также эффективность спонтанного неврологического восстановления.
-
Провести in vitro сравнительное исследование фенотипических и функциональных свойств (пролиферативной активности, супрессорной активности и продукции ростовых факторов) МСК, генерируемых из костного мозга и жировой ткани (липоаспирата).
-
Изучить влияние МСК на восстановление моторных и интеллектуально мнестических функций головного мозга крыс в зависимости от сроков введения клеток(на 1или 7 сутки после травмы) и тканевой принадлежности МСК (МСК костного мозга или жировой ткани) в разработанной модели очагового повреждения головного мозга.
-
Оценить динамику изменений электрофизиологических параметров головного мозга (сомато-сенсорные вызванные потенциалы) в группах животных с трансплантацией МСК костного мозга и липоаспирата и контрольных группах (спонтанное восстановление).
-
На основании гистологических исследований охарактеризовать морфологические изменения в зоне повреждения головного мозга в остром, раннем, подостром и позднем периодах у животных контрольных и исследуемых групп с трансплантацией стромальных мезенхимальных клеток, выделенных их костного мозга и липоаспирата.
Научная новизна. Впервые показано, что моделирование очагового травматического повреждения головного мозга с использованием пружинного механизма силой удара от 0,07 до 0,09 Дж, согласно разработанному нами способу (патент RU 2486602 C1 «Способ моделирования очагового повреждения головного мозга»),вызывает развитие тяжелого неврологического дефицита, который ассоциирован с нарушениями когнитивных функций, характеризуется низким уровнем летальности и отличается продолжительным спонтанным восстановлением моторных функций (на протяжении 21 суток) с сохранением остаточных двигательных нарушений на 45 сутки.
Апробация МСК в указанной модели продемонстрировала безопасность внутривенного введения МСК-КМ и МСК-ЛА на 1-е и 7-е сутки после травмы. Впервые у животных с тяжелым очаговым повреждением головного мозга показано, что трансплантация МСК на 1 сутки приводит к более выраженному регрессу двигательных расстройств (по шкале тяжести двигательных расстройств Chen et al., 2001) и более раннему восстановлению способности к самостоятельному приему пищи. При этом МСК-ЛА обладают более выраженным эффектом по сравнению с МСК-КМ. Позитивный эффект МСК костного мозга и липоаспирата при введении клеток на 7 сутки, а также различия между
МСК различного тканевого происхождения ослабевают и проявляются в виде тренда.
Установлено, что стимулирующий эффект МСК-КМ и МСК-ЛА на восстановление моторных функций ассоциирован с позитивным влиянием МСК на электрофизиологическую активность коры головного мозга. В частности, показано, что в группе с трансплантацией МСК наблюдается более эффективное восстановление параметров корковых соматосенсорных вызванных потенциалов (возрастанием амплитуды, снижением латентности) по сравнению с контрольной группой. Влияние МСК на восстановление электрофизиологической активности коры головного мозга более выражено при введении клеток на 1-е сутки и не различается между МСК костного мозга и липоаспирата. Новые данные получены при сравнительном анализе свойств МСК костного мозга и липоаспирата in vitro. Показано, что по сравнению с МСК-КМ МСК-ЛА характеризуются более высокой продукцией ряда цитокинов (IL-2, IL-13, GM-CSF и эритропоэтина), имеющих отношение к иммунорегуляции и нейрорепарации, что может отчасти объяснять более выраженный стимулирующий эффект МСК-ЛА на восстановление двигательных функций.
На основании морфологических исследований головного мозга животных после трансплантации МСК, полученных из костного мозга и липоаспирата, выявлено, что позитивный эффект при внутривенном введения МСК ассоциирован с активацией ангиогенеза, подавлением деструктивного отека, дистрофических изменений и воспаления и более эффективной организацией поврежденной ткани (образование компактного глиомезодермального рубца с меньшей кистозной дегенерацией).
Практическая значимость. Разработан воспроизводимый способ моделирования очагового травматического повреждения головного мозга с продолжительным выраженным неврологическим дефицитом ( патент RU 2486602 C1 «Способ моделирования очагового повреждения головного мозга» ), который может успешно использоваться для оценки эффективности новых фармакологических препаратов и биомедицинских клеточных продуктов при тяжелой ЧМТ. Данные о безопасности и стимулирующем эффекте МСК костного мозга и липоаспирата на эффективность неврологического восстановления животных в разработанной модели являются, по сути, доклиническим обоснованием для клеточных продуктов на основе МСК костного мозга и липоаспирата в лечении тяжелой ЧМТ и целесообразности проведения клинических исследований. Сопряженность между неврологическим улучшением с динамикой восстановления ССВП головного мозга у животных с трансплантацией МСК свидетельствуют о возможности использования показателей электрофизиологической активности мозга для объективизации эффектов клеточной терапии при ЧМТ в клинической практике.
Внедрение в практику. Результаты исследования включены в учебную программу ФГБУ «ННИИТО им. Я. Л. Цивьяна» МЗ РФ, ГБУЗ НСО ДГКБ№1 « Детская городская клиническая больница №1» при проведении внутрибольнич-
ных конференций и семинаров среди врачей и ординаторов, НИИФКИ«Научно-исследовательский Институт Фундаментальной и Клинической Иммунологии»на кафедре иммунологии при проведении практических занятий, чтении лекций аспирантам и ординаторам.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Моделирование травматического очагового повреждения головного
мозга индуцированного нанесением черепно-мозговой травмы эксперимен
тальному животному через твердую мозговую оболочку с использованием
пружинного механизма силой удара от 0,07 до 0,09 Дж приводит к развитию
тяжелого неврологического дефицита с очаговыми расстройствами и низким
уровнем спонтанного восстановления и морфологически характеризуется мно
жественными, диффузно-очаговыми некродистрофическими изменениями тка
ни мозга на фоне выраженных микроциркуляторных расстройств сосудов мозга
и оболочек, с последующим замещением зоны повреждения рубцовой тканью с
кистозной дегенерацией.
-
Трансплантация мезенхимальных стромальных клеток, полученных из костного мозга и липоаспирата, в разработанной модели является эффективным методом восстановления неврологического дефицита с наилучшим клиническим эффектом при проведении терапии в ранние сроки (первые сутки после травмы), что подтверждается данными клинических, электрофизиологических и морфологических исследований. При этом МСК липоаспирата оказывают большее влияние на восстановление неврологического дефицита по сравнению с МСК костного мозга.
-
Использование мезенхимальных стромальных клеток в лечении тяжелых повреждений головного мозга вне зависимости от их тканевого происхождения, оказывает позитивный эффект на электрофизиологическую активность головного мозга лабораторного животного в виде увеличения значения амплитуды и уменьшения латентности ССВП.
Степень достоверности и апробации материалов диссертации. Достоверность полученных результатов определяется репрезентативным объёмом выборки, использованием современных методов исследования и адекватных методов статистической обработки результатов. Основные положения работы доложены на Всероссийских конференциях: «Поленовские чтения» 2012, 2013, 2014 гг.; «Илизаровские чтения» 2011 г.; Цивьяновские чтения, Новосибирск, 2013; на заседании ассоциации нейрохирургов г. Новосибирска 2015, 2017 гг.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 научных работ, в том числе, 3 статьи в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК России.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 157 страницах, содержит 59 рисунков, 16 таблиц, состоит из введения, трех глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка сокращений и
списка использованной литературы, содержащего 237 источник, из них 46 на русском и 191 на иностранных языках.
Личный вклад автора. Все операции на животных по моделированию травматического очагового повреждения головного мозга автор провел лично. Весь клинический материал, полученный в эксперименте, проанализирован и статистически обработан самим автором.
Экспериментальные модели очаговых ушибов головного мозга, критерии тяжести травмы, оценка двигательных и поведенческих нарушений
Продолжающийся поиск эффективных способов лечения черепно-мозговой травмы (ЧМТ) требует до внедрения в клиническую практику обязательной предварительной оценки изучаемых явлений в эксперименте. Этот этап апробации нового метода лечения сопряжен с рядом трудностей. Во-первых, моделируя ЧМТ у экспериментальных животных, крайне сложно воспроизвести характер и объем повреждения, характеристики течения травматической болезни, которые напоминали бы особенности ЧМТ у человека. Во-вторых, в отечественной литературе, журнальных статьях и диссертационных работах преобладает оценка влияния методов лечения экспериментальной ЧМТ на различные биохимические, иммунологические, электрофизиологические и прочие показатели функций центральной нервной системы (ЦНС). При этом недостаточно внимания уделяется изучению поведенческих реакций, неврологического статуса и неврологических исходов ЧМТ в эксперименте, в то время как эти данные имеют существенное значение в оценке предполагаемого эффекта лечения и влияния на исходы ЧМТ у человека [ 3, 90, 144, 164, 195 ].
Любая модель экспериментальной ЧМТ должна соответствовать ряду критериев. Обычным является учет возраста, пола, массы тела, генетических особенностей используемых животных, условий их содержания, циркадных ритмов и соблюдение отсутствия различий по этим параметрам в контрольной и основной группах. Кроме того, должны быть четко определены такие физические параметры, как точная локализация повреждения и строго определенная тяжесть травмы. Ответ ЦНС на травму должен быть оцениваемым количественно и воспроизводимым в различных лабораториях.
Тяжесть повреждения должна соответствовать прилагаемой к голове или головному мозгу механической силе и пропорционально возрастать при увеличении последней. Используемые в настоящее время модели ЧМТ включают стандартизированные экспериментальные протоколы и хирургические техники. Обязательным условием является изучение в качестве контроля «ложнооперированных» (sham-operated) животных, у которых выполняются все используемые в эксперименте хирургические процедуры, такие как доступ к мозгу для травмирующего устройства, анестезия, поддержание температуры тела и мозга, введение интракраниальных зондов, канюль и т.д., кроме собственно нанесения травмы [ 3, 201 ].
Оценка механических параметров определяющих тяжесть повреждения рассчитывается используя компьютеризированные измерения прилагаемой нагрузки. Параметрами в зависимости от модели могут быть градиенты давления воздействующей на мозг жидкости, скорость ударника, скорость сил, вызывающих ускорение-замедление головы животного. Данные измерения дают возможность осуществлять регулировку травмирующего устройства и поддерживать небольшой диапазон измерений степени тяжести травмы в одном эксперименте [ 3, 54, 114, 169, 201 ]. Известно, степень инвалидизации и качества жизни, социальной адаптации пострадавших с ЧМТ определяется выраженностью нарушений неврологического и психического статуса, а также поражением тонких когнитивных функций.
В настоящее время разработано большое число экспериментальных моделей. Представляем наиболее часто используемые.
Жидкостно-перкуссионная травма мозга (fluid-percussionbraininjury) [ 3, 54 ]. Данная модель ЧМТ часто используемая и изученная у грызунов. Повреждение наносится после разреза кожи и выполнения трефинации быстрым толчком болюса жидкости на неповрежденнуютвердую мозговую оболочку (ТМО) с последующим концентрическим распространением жидкости в эпидуральном пространстве, приводящим к диффузному воздействию на мозг. Травма при использовании данной модели может быть медианной (трефинационное отверстие выполняется по средней линии) и латеральной. Сила давления жидкости может регулироваться, обеспечивая моделирование легкой, среднетяжелой и тяжелой ЧМТ. Данная модель позволяет воспроизвести как местные травматические изменения (корковые ушибы, сопровождающиеся петехиальными интрапаренхиматозными и субарахноидальными кровоизлияниями), так и травматические изменения на удалении от первичного очага (в гиппокампе, зрительном бугре и других отделах мозга), обусловленные вторичными повреждения мозга. Использование жидкостно-перкуссионной модели ЧМТ дает возможность оценить вызываемые травмой двигательные и когнитивные нарушения, а также динамику последних на фоне проводимого лечения.
Модель «контролируемого коркового повреждения» [ 3, 54 ] представляет собойнанесение травмы жестким ударником на интактную ТМО. Голова животного фиксируется. За счет пневматического устройства ударник позволяет регулировать время, скорость и глубину воздействия на мозг.
Приложение небольшой механической энергии обеспечивает моделирование сотрясения головного мозга. Данная модель используется для изучения широкого спектра очаговых повреждений, включающих ушибы головного мозга с формированием эпидуральных или субдуральных гематом. Как и при «жидкостно-перкуссионной модели», она позволяет, помимо локальных, изучать травматические изменения в удаленных отделах головного мозга которые чувствительны к травме, таких как гиппокамп, зрительный бугор, зубчатая извилина и оценить грубые двигательные нарушения, изменения тонкой координации движений, дефицит когнитивных функций.
Модель «ЧМТ в результате падения груза» [ 3, 54 ]. Повреждение наносится в результате свободного падения груза на голову лабораторного животного. Голова животного при этом в большинстве случаев фиксирована, однако многие исследования проводились с нефиксированной головой. Повреждение наносится под анестезией, после разреза кожи и обнажении поверхности черепа. Регулировать массу груза и высоту его падения, можно в больших пределах изменяя степень тяжести ЧМТ. Нет необходимости выполнять трефинацию черепа и малая подготовка животного к нанесению травмы делают эту модель простой и удобной. Недостаток данной модели большой процент переломов черепа при моделировании тяжелой ЧМТ. По аналогии с другим способам нанесения ЧМТ у грызунов, при использовании этой модели отмечен большой диапазон повреждений мозга, от легкой ЧМТ, моделирующей сотрясение головного мозга, до тяжелых очаговых ушибов (под местом падения груза на череп), сопровождающихся вторичной гибелью нервных клеток на отдалении. Также выявлены нарушения двигательной и когнитивной функций.
Модель «ударного ускорения» [ 3, 54 ]. Данная модель разрабатывалась с целью преодоления риска переломов черепа, редко встречающихся при ЧМТ у людей. С этой целью после рассечения кожи и обнажения черепа крысы к кости прочно (с помощью зубного цемента) фиксируется специальный «шлем» — круглая стальная пластина диаметром 1 см. Повреждение наносится падением с высоты на «шлем» груза с тупой поверхностью, что обеспечивает ускорение головы при минимальном локальном воздействии в точке приложения травмирующей силы. При этом голова животного не фиксируется. «Шлем» обеспечивает большое распространение травмирующей силы по поверхности черепа. Как и в других способах, тяжесть травмы может регулироваться массой груза и высотой падения. Данная модель характеризуется, в основном, развитием диффузных повреждений головного мозга, а также локальным повреждением коры, прилежащей к травмируемой области черепа и гибелью клеток в области гиппокампа.
Травма инерционного ускорения [ 3, 54 ]. Известно, что большое число пациентов, травмированных в результате дорожно-транспортных происшествий, получают травму не в результате прямого воздействия на голову, а вследствие ротационных сил, приводящих к диффузному повреждению головного мозга. В настоящее время нет разработанных устройств, надежно воспроизводящие подобную травму у грызунов. Имеются лишь единичные работы, касающиеся моделирования диффузного аксонального повреждения головного мозга у свиней [ 3, 54 ].
Каковы же критерии тяжести травмы и эффективности лечения? Анализ многочисленных литературных источников по экспериментальной медицине показывает, что все накопленные данные способствовали отбору четких морфологических и неврологических критериев тяжести повреждения и эффективности проводимых лечебных мероприятий. Помимо различных методик, используемых для решения специфических задач того или иного исследования, наиболее часто применяются сочетания трех подходов:1) морфологического исследования с количественным определением числа пирамидальных нейронов гиппокампа; 2) оценки двигательных нарушений; 3) оценкикогнитивных функций. [ 3 ].
Морфологическое исследование с количественным определением числа пирамидальных нейронов гиппокампа. Разработанный данный метод базировался на исследованиях временного и пространственного профиля морфологических изменений в головном мозге в ответ на экспериментальную ЧМТ [ 3 ].
Моделирование тяжелого очагового повреждения головного мозга у экспериментальных животных
Моделирование очагового повреждения головного мозгапроводилось в условиях экспериментальной операционной с соблюдением правил асептики и антисептики. В качестве анестезиологического пособия использовалось внутрибрюшинное введение раствора кетамина (125мг/кг).
Проводился дугообразный разрез скальпа, скелетировались лобная и теменная кости черепа и при помощи высокооборотной шаровидной фрезы в лобно–теменно-височной области справа наносилось фрезевое отверстие с последующим его увеличением при помощи детских кусачек Люэра до отверстия 0,5 на 0,5 см. Твердая мозговая оболочка не вскрывалась. Травма наносилась однократно при помощи оригинального ударника с насадкой диаметром 5 мм и пружинным механизмом, фиксированным к вертикальному металлическому держателю; при этом голова животного не фиксировалась [Патент RU 2486602 C1 «Способ моделирования очагового повреждения головного мозга» от 27.06.13] (Рисунок 2).
Данное устройство состоит из штатива с несущей платформой, фиксатора устройства, непосредственно ударника с металлической насадкой диаметром 5 мм и пружинного механизма (Рисунок 3).
Силу удара рассчитывали по энергии ударного воздействия (энергия сжатия пружины), либо по деформации пружины, используя формулу
В зависимости от силы удара были сформированы три контрольных группы животных (Таблица 4).
Животным первой контрольной группы (n=5) повреждение наносилось при растяжении пружины в пределах от 6 до 14 мм (6, 8, 10, 12, 14 мм), или менее 0,06 Дж по энергии ударного воздействия; крысам второй группы (n=38) – при растяжении от 15 до 18 мм (15, 16, 17, 18 мм), или от 0,06 до 0,09 Дж; третьей группы (n=8) – более 18 мм (19, 20, 22, 24, 26, 28, 30 мм), или более 0,10 джоулей по энергии ударного воздействия.
В первой группе с силой удара 0,06 Дж (1-ая группа) летальных исходов во время эксперимента не наблюдалось. Подобная манипуляция приводила к разрыву ТМО, незначительному кровоизлиянию в ложе повреждения, незначительному отеку головного мозга, проявившемся незначительным пролaбированием в трепанационный дефект, стабильной гемодинамикой.
Неврологический дефицит в этой группе имел слабо выраженный характер (от 0 до 6 баллов по Chen et al 2001) и проявлялсяв виде легкого гемипареза, купирующегося самостоятельно к 7 суткам после травмы (Рисунок 4).
У крыс второй группыс силой удара в диапазоне от 0,07–0,09 Дж летальный исход наблюдался в 5,3 % (у 2 из 38) случаев. Подобная манипуляция приводила всегда к разрыву ТМО, достаточно обильному кровотечению в ложе повреждения, которое останавливалось серджеселом, размозжением участка головного мозга в зоне повреждения, выраженному его отеку, проявлившемсязначительным пролабированием в трепанационный дефект, эпизодами неадекватного дыхания. Бал ОТНН в этой группе варьировал от 13 до 18 баллов, что соответствовало тяжелому неврологическому дефициту. У всех особей этой группы наблюдался глубокий гемипарез (в большей степени в задней конечности) и отмечалось значительное снижение тонуса хвоста. Неврологический дефицит купировался через 30–45 суток смомента нанесения травмы (Рисунок 5).
Животные третьей группы контроля с силой удара более 0,09 Дж погибали непосредственно после нанесения удара, либо через несколько часов после травмирующего воздействия. Подобная методика нанесения травмы приводила к разрыву ТМО, обильному кровотечению в ложе повреждения, которое останавливалось с помощью гемостатического материала ( седжесела) размозжение участка головного мозга в зоне повреждения, выраженному отеку и его набуханию, проявляющимся значительным пролабированием в трепанационный дефект, нестабильной гемодинамикой, проявляющейся периодическим отсутствием сердцебиения и неадекватным дыханием.
Всем животным опытных групп в очаг повреждения интраоперационно вводили антибиотик (Sol. Enroxili 5 %–0,05 мг).
В концеоперативного вмешательства всем животным на кожу накладывали послойно швы. В течение 48 часов соблюдали температурный режим в пределах 32 Сисключая переохлаждение. Все животные на 1 сутки получали противоотечную терапию дексаметазоном в дозе 0,05 мг, в/м однократно. Кормление осуществлялось до самопроизвольного приема пищи. Использовалось детское питание «Нутрикомп» или «Фрезубим» через пипетку. Животные, неспособные к приему пищи через пипетку, получали подкожные инъекции физиологического раствора в дозе 3–4 мл/сутки. Далее соблюдались стандартные условия выхаживания.
Исследование эффекта трансплантируемых клеток на динамику электрофизиологической активности мозга в модели тяжелого очагового повреждения
В данном разделе диссертации изучалась электрофизиологическая активность головного мозга у крыс после травмы при спонтанном восстановлении и при трансплантации мезенхимальных клетокв 1-е и 7-е сутки после нанесения травмы методом сомато - сенсорных вызванных потенциалов. Наряду с этим, проводилась сравнительная характеристика эффективности воздействия обоих типов клеток.
В исследовании участвовало 41 животное. В ходе работы были сформированы 6 групп крыс: 1-я группа — животные с трепанацией без нанесения травмы, 2-я группа – «хирургического контроля» (с травмой, но без введения клеток), 3-я – опытная группа (формирование очагового повреждения + введение МСК-КМ на 1-е сутки), 4-я – опытная группа (формированиеочаговогоповреждения + введениеМСК-КМ на 7-е сутки),5-я опытная группа (формирование очагового повреждения + введение МСК-ЛА на 1-е сутки), и 6-я опытная группа (формирование очагового повреждения + введение МСК-ЛА на 7-е сутки). Введение клеток в количестве 1x106 осуществляли на 1-е и 7-е сутки после хирургического вмешательства через поверхностную хвостовую вену. Для достоверной инструментальной оценки функционального состояния мозга при повреждении одного из полушарий и оценки динамики состояния в ходе терапии с применением каждого из видов клеток регистрировались сомато-сенсорные корковые вызванные потенциалы (ССВП) на стимуляцию нервов передних конечностей с помощью электромиографа «Нейропак-2» (NIHON KOHDEN Corp., Япония) [ 9, 11 ].Оценивались нейрофизиологические компоненты ССВП: амплитуда (в мкВ) и латентность (в мс).
Как видно из данных таблицы 14, у животных контрольной группы 1 (трепанация без нанесения травмы) величины амплитуд ССВП и задержек ССВП — как на не травмированной стороне, так и на стороне трепанации — во все сроки наблюденияне отличались от таковых у крыс до проведения трепанации. Это указывает на то, что сама трепанация не вызывает измененийэлектрофизиологической активности головного мозга по данным ССВП. В то же времяу животных группы 2 (трепанация с нанесением травмы) значение амплитуды на стороне повреждения в 1-е сутки после травмы были 5-кратно снижены. Восстановление данного значения в динамике было крайне низким, и к 21 суткам величина амплитудысоставляла 30% от исходного уровня. Кроме того, в этой группе отмечалось увеличение латентности ССВП, которое регистрировалось на всех сроках наблюдения. Характерно, что указанные изменения регистрировались только на стороне повреждения и не выявлялись в интактном полушарии (Рисунок 22).
В таблице 15 приведены данные о величинах амплитуд ССВП и задержек ССВП у животных II, III,V группы в разные сроки тестирования на травмированной стороне. Из таблицы следует, что при введении МСК-КМ и МСК-ЛА на 1суткиувеличения амплитуды ССВПна 7,14 и 21 сутки было достоверно выше, чем в группах контроля. Более выраженное уменьшение латентности в группах с введением МСК-КМ и МСК-ЛА (по сравнению с контролем) отмечалосьна 7 и 21 сутки. Несмотря на достоверное увеличение амплитуды и уменьшения латентности при введении МСК-КМ и МСК-ЛА на 1 сутки, полного восстановления электрофизиологической активности головного мозга не происходит, однако восстановление идет лучше по сравнению с группой 2, где клеточная терапия не проводилась.
В таблице 16 приведены данные о величинах амплитуд ССВП и задержек ССВП у животных 2, 4 и 5 групп в разные сроки тестирования на травмированной стороне. Исходя из таблицы 13, следует, что при введении МСК-КМ и МСК-ЛА на 7 сутки имеются достоверные различия снижения латентности на 21 сутки. По амплитуде имеется тенденция к увеличению на 14 сутки p=0,07.
Таким образом, трансплантация МСК-КМ и МСК-ЛА в 1-е сутки после травмыоказывает равный позитивный эффект на электрофизиологическую активность головного мозга лабораторного животного. Клеточная терапия не обеспечивает полного восстановления электрофизиологических показателей функционирования мозга, но позитивная их динамика при ее применении явно существеннее, чем при спонтанном восстановлении. При введенииклеток на 7-е сутки эффективность клеточной терапии менее выражена.
Обсуждение и выводы. Модель травматического очагового повреждения головного мозга сопряжена с изменением электрофизиологической активности головного мозга у крыс. Трансплантированные МСК-КМ и МСК ЛАпозитивно влияют на динамику восстановления функционального состояния коры обоих полушарий головного мозга в данной модели при введении в первые сутки после травмы. На протяжении всего срока наблюдения восстановлениеамплитуды и латентности до значений, близких к исходным, не происходило. Электрофизиологические параметры на фоне трансплантации клеток статистически значимо отличаются от таковых при спонтанном восстановлении. Использование электрофизиологического контроля является достаточно информативным методом оценки эффективности клеточной терапии.
Особенности морфологической картины в модели очагового повреждения головного мозга на 7, 14, 21 сутки после трансплантации МСК в 1-е и 7-е сутки после ЧМТ
Отличительной морфологической особенностью при введении МСК-ЛА на 1-е сутки является массивный глиоз с акцентированной лимфоцитаной инфильтрации тканей мозга. Стирается картина «ушиба» на 7-е сутки.
Сопоставляя с контрольной группой на 7е сутки после травмы – идет выраженная лимфоцитарная инфильтрация в сочетании с выраженным глиозом.
Особенностью морфологической картины очагового повреждения головного мозга на 14-е сутки после введения МСК-ЛА в 1е сутки по сравнению с контролем являются поля нейрональных клеток, тоесть нельзя исключить явления нейрогенеза (Рисунки 52, 53), однако есть кисты с эпителиальной выстилкой (Рисунок 54). Также обнаруживается грубый субкортикальный рубец (Рисунок 55), граница между зоной повреждения представлена макрофагально-глиальным валом. Обращает внимание наличие образований сосудистого типа, хотя эндотелий больше похож на эпителий (Рисунки 56, 57).
Морфологическая картина при трансплантации МСК-ЛА в 1-е сутки в сравнении с контролем на 21-е сутки после ЧМТ соответствует предшествовавшей группе, только без кист, странных образований.
Обращает внимание продолжающийся нейрогенез на фоне умеренного глиоза, очаги гиперхромных клеток нейрального гистогенеза (Рисунок 58, 59).
В морфологической картине при введении МСК-ЛА на 7-е сутки в сравнении с группой контроля на 21-е сутки после ЧМТприсутствуют краевые некрозы с очаговой лимфоцитарной инфильтрацией этих мест. Нейрональные бласты есть, но их немного.
Морфологическая картина при трансплантации МСК-КМ в 1-е сутки в сравнении с контролем на 14-еи 21-е сутки после ЧМТ аналогична морфологическим изменениям при введении МСК-ЛА.
Патологических тканей при трансплантации МСК в гистологическом материале не выявлено, что может свидетельствовать о безопасности трансплантации.
Выводы: Изучаемая модель характеризуется очагово-диффузным характером поражения. Зональные (кортикальные) некрозы с перивазальными кровоизлияниями диапедезного характера во всех отделах головного мозга наблюдаются уже на 1-е сутки. К 7-м суткам идет формирование плотного, глиально-макрофагального «вала», отграничивающего и внедряющегося в очаги ишемических некрозов с единичными гиалиновыми шарами, визуализируются проявлениеангио-васкулогенеза, а так же отмечается выраженная дистрофия значительного числа крупных нейрональных клеточных форм перифокального «вала» макрофагов и в его составе. То есть картина соответствует диффузному анизоморфному гиперхромному глиозу с ангиогенезом. На 14-е сутки идет формирование ранних склеротических изменений, присоединение умеренных диффузных воспалительных реакций, уменьшение очагов некрозов наряду с уменьшением размеров клеточного отграничительного вала. К 21 суткам имеют место распространенные кортикальные некрозы, продолжается умеренно выраженный капилярогенез и формирование глиоза. Данная модель имеет грубые морфологические изменения, что подтверждается тяжелым, стойким неврологическим дефицитом.
При введении МСК на 1-е сутки после ЧМТ имеет место массивный глиоз с акцентированной лимфоцитаной инфильтрацией тканей мозга.
Стирается картина «ушиба» на 7-е сутки в сравнении с контрольной группой.
Ускоряется созревание глиально-макрофагального «вала. К 14 суткам после трансплантации МСКпо сравнению с контролем появляются поля нейрональных клеток, что может быть связано с явлениями нейрогенеза. К 21 суткам сохраняются явления кортикальных некрозов. Морфологические изменения при трансплантации МСК-КМ и МСК-ЛА в разные сроки трансплантации аналогичные и свидетельствуют об ускорении процессов репарации в исследуемой модели. В данной работе показана безопасность трансплантации МСК.