Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современное состояние проблемы исследования генетических аберраций в глиобластомах у детей (обзор литературы) 23
1.1. Глиобластомы у детей. Общие положения 23
1.2. Глиосаркомы у детей 25
1.3. Глиобластомы у детей младше 3 лет 26
1.4. Цитогенетические аберрации в глиобластомах 27
1.5. Мутации в глиобластомах 27
1.6. Эпигенетические события в глиобластомах 29
1.6.1. Модификации гистонов и ремоделирование хроматина в глиобластомах 32
1.7. Глиобластомы больших полушарий 35
1.7.1. Цитогенетические аберрации 35
1.7.2. Мутации 35
1.8. Глиобластомы зрительного бугра 36
1.9. Глиобластомы ствола головного мозга з
1.9.1. Цитогенетические аберрации 39
1.9.2. Мутации 39
1.10. Глиобластомы мозжечка 39
1.11. Глиобластомы спинного мозга 40
1.12. Заключение 40
Глава 2. Материал и методы исследования 42
2.1. Общая характеристика клинического материала 42
2.1.1. Характеристика нейрохирургических методов лечения 44
2.1.2. Глиобластомы больших полушарий головного мозга 46
2.1.2.1. Характеристика опухолей по данным КТ и МРТ... 46
2.1.2.2. Показания к операции 48
2.1.2.3. Особенности операции и интраоперационная морфология 48
2.1.3. Глиобластомы подкорковых узлов 49
2.1.3.1. Характеристика опухолей по данным КТ и МРТ... 49
2.1.3.2. Показания к операции 51
2.1.3.3. Особенности операции и интраоперационная морфология 51
2.1.4. Глиобластомы ствола головного мозга 52
2.1.4.1. Характеристика опухолей по данным КТ и МРТ 52
2.1.4.2. Показания к хирургическому лечению 52
2.1.4.3. Особенности операции и интраоперационная морфология 54
2.1.5. Глиобластомы задней черепной ямки 54
2.1.5.1. Характеристика опухолей по данным КТ и МРТ 54
2.1.5.2. Показания к операции 54
2.1.5.3. Особенности операции и интраоперационная морфология 55
2.1.6. Глиобластомы спинного мозга 57
2.1.6.1. Характеристика опухолей по данным КТи МРТ 57
2.1.6.2. Показания к операции 57
2.1.6.3. Особенности операции и интраоперационная морфология 57
2.2. Характеристика методов адъювантного лечения нейрохирургических больных с глиобластомами 59
2.3. Формирование групп для исследования биологии глиобластом у нейрохирургических больных 61
2.4. Катамнестические данные у нейрохирургических больных с глиобластомами 66
2.5. Методы исследования биологии глиобластом у нейрохирургических больных 67
2.5.1. Морфологическое исследование глиобластом 67
2.5.2. Иммуногистохимическое исследование глиобластом 68
2.5.2.1. Методика иммуногистохимического исследования.69
2.5.3. Флуоресцентная гибридизация in situ в глиобластомах 70
2.5.3.1. Методика флуоресцентной гибридизации in situ.. 71
2.5.4. Сравнительная геномная гибридизация глиобластом 73
2.5.4.1. Методика сравнительной геномной гибридизации..74
2.5.4.2. Анализ результатов сравнительной геномной гибридизации 76
2.5.5. Полное экзомное секвенирование глиобластом 77
2.5.5.1. Методика полного экзомного секвенирования 78
2.5.5.2. Анализ результатов полного экзомного секвенирования 81
2.5.6. Метиляционное профилирование ДНК в глиобластомах 81
2.5.6.1. Основные методы бисульфитного секвенирования..82
2.5.6.2. Методика метиляционного профилирования ДНК с использованием Illumina HumanMethylation450 BeadChip 83
2.5.6.3. Анализ данных метиляционного профилирования..84
2.5.6.4. Оценка статуса метилирования гена MGMT в глиобластомах 85
2.5.7. Полимеразная цепная реакция в исследовании глиобластом 86
2.5.8. Прямое секвенирование глиобластом 88
2.5.9. Статистический анализ выживаемости у нейрохирургических больных с глиобластомами 89
Глава 3. Результаты исследования биологии глиобластом у нейрохирургических больных 90
3.1. Морфологическая и молекулярная дифференциальная диагностика низкодифференцированных злокачественных опухолей головного мозга у детей 90
3.2. Выявление генетических нарушений в глиобластомах методами Illumina HumanMethylation450 BeadChip, сравнительной геномной гибридизации (array-based omparative genomic hybridization a-CGH) и флуоресцентной гибридизации in situ (Fluorescence in situ hybridization FISH) 118
3.2.1. Выявление генетических нарушений в глиобластомах методом Illumina HumanMethylation450 BeadChip 118
3.2.2. Выявление генетических нарушений в глиобластомах методом сравнительной геномной гибридизации 126
3.2.3. Выявление генетических нарушений в глиобластомах методом флуоресцентной гибридизации in situ 133
3.2.4. Связь выявленных в глиобластомах цитогенетических аберраций с гистологической картиной опухоли 136
3.3. Выявление в глиобластомах мутаций генов методами полного экзомного секвенирования (Whole exome sequencing WES) и прямого секвенирования (Direct sequencing), выявление мутантных протеинов методом иммуногистохимического исследования, выявление эпигенетических нарушений в методом метиляционного анализа ДНК (DNA methylation profiling) 137
3.3.1. Анализ мутаций генов в глиобластомах методом полного экзомного секвенирования 137
3.3.2. Анализ мутаций генов H3F3A, IDH1 и BRAFB глиобластомах методом прямого секвенирования 137
3.3.3. Иммуногистохимическое выявление мутантных протеинов К27М, IDH1 и BRAF в глиобластомах 144
3.3.4. Выявление эпигенетических нарушений методом метиляционного анализа ДНК 146 3.3.5. Кластерный анализ результатов, полученных при изучении эпигенома детских глиобластом 154
3.3.6. Статистический анализ выживаемости нейрохирургических
больных с глиобластомами 156
3.3.6.1. Регрессивная модель Кокса 161
3.3.7. Клинико-молекулярная стратификация глиобластом 162
Глава 4. Обсуждение полученных результатов 165
4.1. Клинико-морфологическое сопоставление полученных аберраций и их прогностическое значение в глиобластомах у нейрохирургических больных 165
4.2. Биологическое значение выявленных в глиобластомах генетических аберраций и мутаций генов и их роль для таргетной терапии опухолей у нейрохирургических больных 175
Заключение 197
Выводы 210
Практические рекомендации 213
Список литературы
- Модификации гистонов и ремоделирование хроматина в глиобластомах
- Особенности операции и интраоперационная морфология
- Полимеразная цепная реакция в исследовании глиобластом
- Иммуногистохимическое выявление мутантных протеинов К27М, IDH1 и BRAF в глиобластомах
Введение к работе
Актуальность темы исследования
В настоящее время детская нейрохирургия, зарождение которой связано
с именем А.А. Арендта, учитывающая тонкие анатомо-физиологические
особенности строения головного и спинного мозга у детей, из узкой
хирургической специальности превратилась в важную составляющую детской
нейроонкологической службы, в которой главенствует принцип
междисциплинарного подхода к диагностике и лечению опухолей головного и
спинного мозга. Для обеспечения мультидисциплинарного и мультицентрового
подхода созданы и успешно функционируют «Московская группа по детской
нейроонкологии» и «Совет по нейроонкологии», включающие специалистов
(нейрохирургов, нейрорентгенологов, неврологов, лучевых терапевтов,
химиотерапевтов, нейропатоморфологов, нейроэндокрино логов,
нейроофтальмологов и нейропсихологов) из разных научно-клинических центров Москвы и России. Именно на стыке наук - нейрохирургии, нейроморфологии, нейробиологии, нейрогенетики и нейроонкологии -появляются новые данные, позволяющие переосмысливать наши подходы к лечению злокачественных опухолей центральной нервной системы.
Глиобластома - наиболее часто встречающаяся злокачественная опухоль головного мозга (заболеваемость глиобластомой составляет 12-15% от всех интракраниальных опухолей и 60-75% от всех астроцитарных опухолей), характеризующаяся низкими показателями общей выживаемости (Burger Р.С, 2007; Burger Р.С., 2012; Louis D.N., 2007).
До настоящего момента важной проблемой остается гистологическая верификация глиобластом, особенно изоморфноклеточного варианта, требующего проведения дифференциальной диагностики с другими
ч
злокачественными мелко кругло клеточными опухолями (Hales R.K., 2010; Perry А., 2009).
Глиобластомы у детей и взрослых имеют идентичную гистологическую картину и одинаково неблагоприятный прогноз, поэтому долгое время рассматривались совместно. Основное различие заключается в патогенезе этих опухолей: структура выявляемых цитогенетических аберраций, таких как амплификации онкогенов EGFR, PDGRFA, MY С и MYCN, гомозиготная делеция гена CDKN2A и делеция гена PTEN существенно отличается в глиобластомах у данных возрастных групп, что говорит о вовлечении различных молекулярных путей в развитие этих опухолей у детей и взрослых (Byeon S-J., 2012; Масу М.Е., 2012; Ohgaki Н., 2009; Rickert С.Н., 2001; Suri V., 2009).
Определенную роль в развитии глиобластом играют эпигенетические события: метилирование ДНК, посттрансляционная модификация гистонов и посттранскрипционная регуляция генной экспрессии микроРНК (Сагёп Н., 2013; Dubuc A.M., 2012).
Поворотным моментом в исследовании генома глиобластом и создании молекулярной классификации явилось открытие мутаций генов IDH1 (Parsons D.W.,2008) и H3F3A (Schwartzentraber J., 2012).
Точковые мутации гена ЮНІ в кодоне 132, возникающие в глиобластомах, являются гетерозиготными и соматическими и характеризуются заменой пары оснований гуанина на аденин в результате замены аминокислоты аргинина (R) в позиции 132 на гистидин (Н) (R132H) (Balss J., 2008). Глиобластомы с мутацией гена IDH1 имеют более благоприятные показатели общей выживаемости (Рыжова М.В., 2014; Deimling А., 2011; Hartmann С, 2010).
Гетерозиготные мутации гена H3F3A впервые в мире описаны в детских глиобластомах с нашим участием (Schwartzentraber J., 2012) в двух вариантах:
замена лизина (К) на метионин (М) (К27М) и глицина (G) на аргинин (R) или валин (V) (G34R/V). Обе мутации возникают в позиции, близкой к концевой N-терминали, которая подвергается важным посттрансляционным изменениям, связанным либо с подавлением (К27) либо с активацией (КЗ6) процесса транскрипции.
Глиобластомы у детей представляют собой гетерогенную группу, среди которой, несмотря на низкие показатели 5-летней общей выживаемости, встречаются отдельные "долгожители". Возраст младше 3 лет также считается прогностически благоприятным признаком для глиобластом.
Генетические аберрации подробно изучены только во взрослых глиобластомах, что касается детских глиобластом - на сегодняшний момент в мировой литературе почти нет данных, касающихся генетики детских глиобластом на больших сериях, что и послужило основной целью данной работы - изучить цитогенетические аберрации и эпигенетические события на большой группе детких глиобластом, сравнить их со взрослыми опухолями и оценить прогностическое значение выявленных нарушений в геноме и эпигеноме.
Степень разработанности темы
На сегодняшний момент мало известно о молекулярно-генетических аберрациях, мутациях и эпигенетических событиях в детских глиобластомах, данная работа является пионерской в области генетики детских глиобластом, особенно на столь крупной серии опухолей.
Цель исследования
Оптимизировать подходы к комплексному лечению глиобластом и улучшить прогнозирование исходов лечения нейрохирургических больных на основе исследования генетических и эпигенетических нарушений в глиобластомах у детей в возрасте младше 18 лет, сравнить выявленные нарушения в геноме с контрольной группой уже исследованных глиобластом
взрослых, разработать основанную на молекулярных маркерах схему прогноза и определить возможные гены-мишени для таргетной терапии.
Задачи исследования
-
Оценить нейрохирургическую тактику в зависимости от нарушений в геноме детских глиобластом.
-
Разработать алгоритм дифференциальной диагностики низкодифференцированных злокачественных опухолей головного мозга у детей, основанный на молекулярных методах.
-
Исследовать молекулярно-генетические аберрации в геноме детских глиобластом методами Illumina HumanMethylation450 BeadChip, сравнительной геномной гибридизации (Array-based Comparative Genomic Hybridization a-CGH) и флуоресцентной гибридизации in situ (Fluorescence in situ hybridization FISH).
-
Исследовать мутации и эпигенетические события в глиобластомах методами полного экзомного секвенирования (Whole exome sequencing WES), прямого секвенирования (Direct sequencing) и метиляционного анализа ДНК (DNA methylation profiling), а также выявить мутантные протеины методом иммуногистохимического исследования.
-
Сравнить молекулярно-генетические нарушения в геноме глиобластом у детей и взрослых с целью разработки «возрастной» молекулярной стратификации.
-
Собрать катамнестические данные у нейрохирургических больных и оценить прогностическую значимость выявленных молекулярно-генетических нарушений в глиобластомах.
-
Оценить биологическую роль выявленных аберраций и определить возможные гены-мишени для таргетной терапии глиобластом.
(\
Научная новизна
Подробно изучены нарушения в геноме и эпигенетические события в детских глиобластомах благодаря использованию новейших методов исследования, таких как полное экзомное секвенирование (whole exome sequencing WES), метиляционный анализ ДНК (DNA methylation profiling) и прямое секвенирование (direct sequencing). При сравнении генетических аберраций и эпигенетических событий в глиобластомах у детей и взрослых выявлены различия в биологии опухоли у разных возрастных групп, определены прогностические маркеры для детских (амплификации онкогенов, вариант К27М мутации гена H3F3A и метилированый ген MGMT) и взрослых глиобластом (мутация гена IDH1), что позволяет рассматривать эпигенетические события в качестве мишени для будущей таргетной терапии.
В рамках международного проекта "Детские глиобластомы", в котором автор данной диссертационной работы принимала непосредственное участие, впервые в мире в глиобластомах у детей была выявлена и описана мутация гена H3F3A, кодирующего гистон НЗ.З (Schwartzentruber J., 2012), что вошло в пятерку наиболее важных событий в нейроонкологии (Schiff D., 2013).
Теоретическая и практическая значимость
Полученные данные позволили сформулировать концепцию о
молекулярно-генетической гетерогенности глиобластом разных возрастных
групп. Результаты работы позволили оптимизировать тактику
нейрохирургического пособия при глиобластомах различной локализации у
детей; объяснено благоприятное прогностическое значение возраста младше 2
лет у детей с опухолями, имеющими гистологические признаки глиобластом,
но молекулярно демонстрирующими профиль глиом низкой степени
злокачественности; объяснен феномен длительной выживаемости у детей с
опухолями, имеющими гистологические признаки глиобластом, но
молекулярно демонстрирующими профиль злокачественной плеоморфной
ксантоастроцитомы; определены прогностически значимые цитогенетические аберрации, эпигенетические события и мутации у больных детского возраста с глиобластомами. Негативное влияние на прогноз при детских глиобластомах оказывают следующие факторы: наличие мутации гена H3F3A вариант К27М, наличие амплификации любого из перечисленных (EGFR, PDGFRA, MYC/MYCN, CDK/CCND) онкогенов, а также срединная и глубинная локализация опухоли (в таламусе, стволе головного мозга и спинном мозге), в то время метилированный ген MGMT позитивно влияет на прогноз заболевания. Разработан и внедрен в практику патолого-анатомического отделения ФГБНУ «НИИ нейрохирургии им. акад. Н.Н. Бурденко» алгоритм диагностики низкодифференцированных злокачественных опухолей, а также исследование глиобластом методом флуоресцентной гибридизации in situ для выявления возможных цитогенетических аберраций.
Материалы работы планируется использовать для дальнейшего развития и совершенствования детской нейроонкологической службы.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Глиобластомы у детей представляют собой гетерогенную группу опухолей, относительно однородную по клинической картине и гистологии, но демонстрирующей четкие различия по молекулярному профилю и, как следствие, прогнозу и таргетной терапии заболевания. Детские глиобластомы отличаются от взрослых опухолей по цитогенетическому профилю и наличию ключевой повторяющейся мутации гена H3F3A, возникающей в 50% детских опухолей.
-
Согласно метиляционному профилированию генов детские глиобластомы могут быть разделены на четыре кластера: К27М, G34R/V, IDH1 и wt GBM. Кластерирование взрослых глиобластом имеет иную структуру: у них отсутствуют кластеры К27М и G34R/V.
я
-
Детские глиобластомы формируют три основные группы (К27М, G34R/V и с отсутствием мутации гена H3F3A) с клиническими, биологическими и прогностическими особенностями (группа IDH1 у детей с глиобластомами малочисленна). Взрослые глиобластомы подразделяются на две прогностически различные группы в зависимости от наличия или отсутствия мутации т&шЮН1.
-
Метилирование гена MGMT гораздо чаще встречается во взрослых глиобластомах и сочетается с мутацией гена IDH1 в обеих возрастных группах и с мутацией гена H3F3A вариант G34R/V в детских опухолях.
Степень достоверности
Теория построена на известных проверенных фактах и согласуется с современными представлениями и опубликованными экспериментальными данными по теме диссертации; использованы сравнения авторских данных с литературными данными, полученными ранее по рассматриваемой тематике; установлено количественное и качественное совпадение авторских результатов с данными, представленными в независимых источниках по данной тематике; использованы современные методы сбора и обработки исходной информации.
Апробация работы
Основные положения и материалы диссертации были доложены на совместном заседании общества по нейроонкологии и американской ассоциации нейрохирургов/собрания нейрохирургов г. Новый Орлеан, 2009; на конференции по детской нейроонкологии и трансляционным исследованиям г. Новый Орлеан, 2011; на 43-ем конгрессе международного общества по детской онкологии г. Окленд, 2011; на 15-ом международном симпозиуме по детской нейроонкологии г. Торонто, 2012; на конференции «Первичные и метастатические опухоли головного мозга. Мультидисциплинарный подход к решению проблем» г. Ростов-на-Дону, 2013; на конференции «II Российский Нейрохирургический Форум Нейроонкология» г. Екатеринбург, 2013; на
научно-практической конференции «Мультидисциплинарные подходы в онкологии» г. Москва, 2014; на семинарах отделения педиатрической нейроонкологии German Cancer Research Center in the Helmholtz Association (DKFZ), г. Хайдельберг 21 августа 2014 г. и 19 февраля 2015 г.; г. на расширенном совместном заседании проблемных комиссий «Детская нейрохирургия» и «Биология и комплексное лечение внутримозговых опухолей» в ФГБНУ «НИИ нейрохирургии им. акад. Н.Н. Бурденко» 5 декабря 2014.
Публикации
По теме работы опубликовано 50 печатных работ, включая 27 статей в научных рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК для докторских диссертаций (из них 9 статей опубликовано в отечественных журналах и 18 статей в зарубежных журналах). 21 работа опубликована в виде статей и тезисов на профильных отечественных и зарубежных конференциях и конгрессах (из них 15 тезисов в англоязычных сборниках, 4 тезиса в отечественных сборниках и 2 статьи в отечественных медицинских журналах). Две работы опубликованы в виде клинических рекомендаций: «Ассоциация нейрохирургов России. Стандарты, опции и рекомендации в лечении первичных опухолей ЦНС (2012-2013)» и «Клинические рекомендации. Неврология и нейрохирургия / под ред. Е.И. Гусева, А.Н. Коновалова».
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, 4 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы и приложения. Текст изложен на 265 страницах, содержит 46 рисунков и 8 таблиц. Список литературы содержит ссылки на 18 отечественных и 312 зарубежных источников.
Модификации гистонов и ремоделирование хроматина в глиобластомах
Глиобластома - злокачественная опухоль головного и спинного мозга, возникающая из клеток радиальной глии и единственная из всех глиом имеющая самую высокую четвертую степень злокачественности [122, 127, 172, 182, 183, 187, 252, 288]. У детей глиобластомы чаще поражают срединные структуры головного мозга: зрительный бугор и ствол головного мозга, в отличие от полушарных глиобластом взрослых [6, 187].
Протокол лечения глиобластомы у детей включает максимально радикальное безопасное хирургическое удаление опухоли, лучевую и химиотерапию. Для обеспечения максимально возможной радикальности удаления и предотвращения послеоперационного неврологического дефицита применяются ультразвук, функциональное картирование, операции с пробуждением, рамочные навигационные системы и интраоперационная нейровизуализация. В зависимости от локализации опухоли установлены подходы к лечению: опухоли глубинной локализации не могут быть удалены хирургически, для таламических глиом хирургическое удаление только ухудшает прогноз, в таких случаях предпочтение отдается диагностической стереотаксической биопсии (или в случае интравентрикулярной опухоли -нейроэндоскопической биопсии) с последующей лучевой терапией [6, 117, 140, 325]. Лучевая терапия для лечения глиобластом у детей старше трех лет применяется в дозе 50-60 Грей со стандартным ежедневным фракционированием 1,8-2,0 Грей.
Химиотерапия используется совместно с лучевой терапией глиобластом, применяются Lomustine (l-[2-chloro-ethyl]-3-cyclohexyl-l-nitrosourea, CCNU) и Vincristine в комбинации с Procarbazine (PCV). Исследования показали, что Temozolomide менее эффективен у детей с глиобластомами, чем у взрослых [3, 4, 5,141,152,176,281].
Глиобластомы - злокачественные опухоли, склонные к быстрому прогрессированию за счет локального рецидивирования или метастазирования, несмотря на удаление опухоли и химиолучевую терапию. От истинной прогрессии опухоли следует отличать так называемую «псевдопрогрессию», когда на МРТ появляются участки накопления контрастного вещества, связанные с воспалением на фоне терапии, постхирургическими изменениями, ишемией и отеком. Клинически псевдопрогрессия опухоли как правило протекает бессимптомно. Дифференциальный диагноз между прогрессией и псевдопрогрессий опухоли можно провести при помощи перфузионной МРТ и диффузионно-взвешенной МРТ с последующим анализом коэффициента диффузии [73, 324].
Метастазирование в глиобластомах связывают с повышенной экспрессией маркера стволовых клеток CD133 (ген Prominin 1) [261]. Метастазирование на момент диагноза (так называемое первичное метастазирование) развивается приблизительно у 3% детей с глиобластомами любой локализации, в то время как вторичное метастазирование развивается у 13% глиобластом ствола и 22% нестволовых глиобластом через 7-8 месяцев после постановки диагноза «глиобластома». Выживаемость после вторичного метастазирования не превышает 4 месяцев, вторичное метастазирование является неблагоприятным прогностическим фактором [36, 307]. Для лечения рецидивных опухолей используется повторное хирургическое удаление опухоли, позволяющее не только резецировать объем патологической ткани, но и получить материал для изготовления дендритной вакцины [116, 240]. За хирургическим удалением следуют повторная лучевая терапия (хорошо зарекомендовала себя в лечении рецидивных глиобластом у детей гипофракционированная стереотаксическая лучевая терапия) и химиотерапия с Bevacizumab (Avastin) в качестве монотерапии или в сочетании с Irinotecan [94, 109, 327].
Основными факторами благоприятного прогноза для глиобластом детского возраста на сегодняшний день принято считать возраст младше 3 лет [10] и тотальное удаление опухоли, возможное только в случае поверхностной полушарной локализации [80, 117, 227, 323].
Глиосаркома - вариант глиобластомы с наличием саркоматозного компонента, появляющегося в результате метаплазии глиальных клеток, а не пролиферирующих сосудов, как считалось ранее. На сегодняшний день моноклональный источник глиального и мезенхимального компонента глиосаркомы доказан на молекулярном уровне [154, 187, 243].
Частота заболеваемости глиосаркомами у детей не превышает 2% от всех глиобластом детского возраста. Отмечено 2 пика заболеваемости - у детей младше 1 года и в возрасте 10-11 лет. Локализуются глиосаркомы преимущественно супратенториально чаще всего в лобной доле, но описаны единичные случаи глиосарком таламуса [154, 211, 239].
Выделяют три группы глиосарком у детей. Первая группа возникает у младенцев в возрасте 1-4 месяцев, имеет хороший прогноз и может быть лечена с использованием хирургического удаления и химиотерапии. Возможно, данные глиобластомы являются врожденными и представляют собой опухоль по биологическим характеристикам сильно отличающуюся от обыкновенной глиосаркомы [132, 190, 221, 256]. Вторая группа развивается у детей более старшего возраста после полученной ранее краниальной лучевой терапии по поводу глиом низкой степени злокачественности, медуллобластом, острого лимфобластого лейкоза, ангиом, менингиом и гигантоклеточных глиобластом. У детей со вторичными глиосаркомами прогноз плохой в отличие от взрослых с индуцированными лучевой терапией глиосаркомами [83, 139, 154, 192, 256]. Третья группа глиосарком развивается у детей старше 3 лет de novo, прогноз у данной категории пациентов неблагоприятный [154, 256].
У взрослых больных и мезенхимальный и глиальный компоненты глиосаркомы имеют цитогенетические и молекулярные аберрации сходные с аберрациями, выявляемыми в первичных глиобластомах: за исключением более низкой частоты амплификации гена EGFR. Делеции генов CDKN2A, PTEN и мутации гена ТР53 встречаются в 20-40% глиосарком у взрослых [243].
Цитогенетические и молекулярные аберрации, а также мутации генов в детских глиосаркомах не изучены и в литературе не описаны.
Возраст младше 3 лет является благоприятным прогностическим фактором. В этом возрасте для лечения глиобластом используются хирургическое удаление опухоли с последующей химиотерапией. Применение лучевой терапии ограничено из-за когнитивных и нейроэндокринных осложнений, но может быть использовано для лечения рецидивных опухолей и лечения первичной опухоли после достижения ребенком трехлетнего возраста [43, 89, 138, 257].
Химиотерапию следует начинать через месяц после удаления опухоли. Лечение включает три альтернативных режима: Карбоплатин, Прокарбазин или Этопозид, Цисплатин или Винкристин, Циклофосфамид - 7 циклов с 3-недельными интервалами под контролем гематологических показателей. Химиотерапия может осложниться нейротоксичностью или гематотоксичностью, хотя маленькие дети обычно хорошо переносят лечение [89, 245, 279]. Глиобластома у маленьких детей представляет собой отдельную уникальную группу с относительно благоприятным прогнозом, возможно, из-за отсутствия гиперэкспрессии и мутации гена ТР53, выявляемой только в 9% опухолей и связанной с неблагоприятным результатом в глиобластомах данной возрастной группы [257]. Генетические исследования глиобластом у маленьких детей выявили лишь небольшое количество генов, экспрессия которых отличается у маленьких детей, детей старшей возрастной группы и взрослых больных с глиобластомами. Также при исследовании глиобластом у маленьких детей не было выявлено ни амплификации генов EGFR и PDGFRA, ни гомозиготной делеции гена CDKN2A, ни мутации гена H3F3A, лишь в небольшом проценте опухолей определялась делеция гена. PTEN [45, 190].
Особенности операции и интраоперационная морфология
Также исследование на уровне тотального генома показало, что из 26 опухолей ранее диагностированных как глиобластомы и имеющих гистологические признаки злокачественных астроцитарных глиом, 22 (13%) оказались плеоморфными ксантоастроцитомами и 4 (2%) глиомами низкой степени злокачественности - эти опухоли также были исключены из дальнейшего исследования.
Четыре исключенных из дальнейшего исследования опухоли, согласно результатам молекулярного исследования с помощью Illumina HumanMethylation450 оказавшимися глиомами низкой степени злокачественности (рисунок 19), гистологически были представлены астроцитомами с признаками малигнизации и некрозами с псевдопалисадными структурами (рисунок 18), то есть согласно классификации опухолей ЦНС ВОЗ от 2007 соответствовали гистологическому диагнозу "глиобластома WHO grade IV». Все четыре опухоли возникли у маленьких детей (трех мальчиков и одной девочки) в возрасте от 2 месяцев до 1 года 4 месяцев, это были супратенториальные полушарные опухоли, две из которых были удалены тотально, другие две субтотально; метастазирование опухоли отсутствовало во всех случаях. Прогрессия опухоли и смерть от основного заболевания произошли у одного мальчика, трое других детей были живы без признаков прогрессии заболевания в течение 35, 39 и 42 месяцев соответственно. Ни одна из четырех опухолей не имела каких-либо цитогенетических аберраций; мутаций генов H3F3A, IDH1 или BRAF V600E также не было выявлено.
Из 22 опухолей, классифицированных методом Illumina как плеоморфные ксантоастроцитомы (рисунок 22), все опухоли имели гистологические особенности злокачественных астроцитарных глиом (рисунок 20А) с выраженным полиморфизмом ядер и клеток, большим количеством митозов, наличием толстостенных крупных сосудов, очаговой пролиферацией эндотелия сосудов, обширными очагами некрозов на фоне тромбированных сосудов и некрозами с псевдопалисадными структурами, также опухоли содержали эозинофильные гранулярные тельца и периваскулярную лимфоидную инфильтрацию.
Из 22 опухолей 13 возникли у мальчиков, 9 опухолей - у девочек. У двух пациентов опухоли развились в возрасте 3 лет, у 8 пациентов - в возрасте от 4 до 7 лет, у 11 пациентов - в возрасте от 8 до 15 лет и еще две опухоли возникли у шестнадцатилетних детей. 18 (82%) плеоморфных ксантоастроцитом имели супратенториальную локализацию, 17 опухолей были полушарными, одна плеоморфная ксантоастроцитома поражала таламус; 3 опухоли (14%) располагались в среднем мозге и 1 опухоль (4%) имела спинальную локализацию на уровне C4h5 позвонков. 11 плеоморфных ксантоастроцитом (50%) были удалены полностью (все опухоли за исключением одной имели полушарную локализацию), 11 опухолей были удалены субтотально. Прогрессия заболевания возникла в 14 случаях (64%), в большинстве случаев (12 случаев - 86%) это был продолженный рост опухоли, в одном случае наступили последовательное локальное рецидивирование и дистантное метастазирование опухоли и в одном случае метастазирование опухоли по оболочкам головного и спинного мозга при стабилизации процесса в области первичной опухоли; смерть от прогрессии заболевания наступила у 8 пациентов (36%). Что касается молекулярных особенностей плеоморфных ксантоастроцитом, то 13 опухолей (59%) имели мутацию BRAF V600E или V600R, выявленную методом прямого секвенирования (рисунок 21) и подтвержденную в 100% случаев иммуногистохимическим исследованием (рисунок 20Б); мутации генов H3F3A или IDH1 не было выявлено ни в одной опухоли. Три опухоли (14%) имели метилированный ген MGMT. 17 опухолей (77%) имели сбалансированный профиль и отсутствие цитогенетических аберраций, в четырех опухолях имелись единичные аберрации - амплификация гена MYCN, две гомозиготных делеции гена CDKN2A и потеря хромосомы 10q. В одной опухоли имелось сочетание аберраций: гомозиготной делеции гена CDKN2A и потери хромосомы 10q.
Электрофореграмма. Мутация гена BRAF V600R в плеоморфной ксантоастроцитоме с малигнизацией, выявленная методом прямого секвенирования генов. Нуклеотиды в комплементарных парах А-Т и G-C метятся четырьмя различными флуорохромными красителями: аденин (А) - зеленым цветом, гуанин (G) - черным цветом, цитозин (С) - синим цветом и тимин (Т) - красным цветом. При возникновении мутации происходит замена одной аминокислоты на другую, что приводит к замене пар оснований, в данном случае имеет место замена валина на аргинин и гуанина на аденин в позиции 57. Верхняя электрофореграмма - использован праймер с прямой последовательностью, нижняя электрофореграмма - праймер с обратной последовательностью.
Для определения роли молекулярных маркеров и клинико- патологических параметров была использована регрессивная модель Кокса для плеоморфных ксантоастроцитом, не выявившая значимого влияния какого-либо фактора на выживаемость. Также мы сравнили безрецидивную и общую выживаемость глиом низкой степени злокачественности, плеоморфных астроцитом и глиобластом (рисунки 23 и 24) - 5-летняя общая выживаемость для глиобластом детского возраста составила 10%, для плеоморфных ксантоастроцитом с малигнизацией 48%, для определения 5-летней общей выживаемости для детей с молекулярными особенностями глиом низкой степени злокачественности было недостаточно данных, но трое из четырех пациентов были живы без признаков прогрессии заболевания на момент окончания сбора катамнестических исследований 35, 39 и 42 месяца соответственно.
Полимеразная цепная реакция в исследовании глиобластом
Гистологическая диагностика опухолей центральной нервной системы является важным этапом общего процесса диагностики и лечения новообразований головного мозга, включающего помимо морфологической верификации до- и послеоперационную нейровизуализацию, хирургическое удаление опухоли и адъювантную терапию. Правильно поставленный гистологический диагноз позволяет нейроонкологам выбрать соответствующий протокол лечения и контролировать заболевание. Известно, что применение обладающего противоопухолевой активностью антибиотика доксорубицина для лечения атипической тератоидно-рабдоидной опухоли улучшило показатели общей выживаемости, а глиобластомы согласно текущим протоколам лечения в отличие от ПНЭО ЦНС не требуют проведения краниоспинального облучения [57, 64,71,82,208,276,299].
В последние годы благодаря изучению молекулярно-генетических особенностей злокачественных опухолей головного мозга у детей и разработке новых диагностических маркеров для иммуногистохимического исследования процесс гистологической верификации опухолей значительно упростился, но по-прежнему требует внимательного отношения и знаний о точной локализации опухоли [50, 51, 91, 187, 151, 162, 204].
Часто как детские так и взрослые опухоли имеют сходную гистологическую картину низкодифференцированной мелко круглоклеточной злокачественной опухоли, но под описанной гистологической картиной может скрываться 166 множество новообразований, которые по биологическим свойствам и подходам к лечению представляют собой абсолютно разные группы опухолей, требующие собственных протоколов лечения [38, 42, 52, 70, 72, 96, 99, 148, 277].
Спектр опухолей у детей (особенно у детей младшего возраста), требующих проведения дифференциального диагноза с глиобластомой достаточно широк и включает прежде всего эмбриональные новообразования: атипическую тератоидно-рабдоидную опухоль, реже эмбриональную опухоль с многорядными розетками и ПНЭО ЦНС. Также в некоторых случаях трудно отличить глиобластому от анапластической эпендимомы, для которой характерна точечная экспрессия ЕМА в цитоплазме опухолевых клеток, и плеоморфной ксантоастроцитомы с признаками малигнизации.
Атипическая тератоидно-рабдоидная опухоль редко показывает классическую картину опухоли с присутствием фракции лежащих отдельно друг от друга крупных рабдоидных клеток с эозинофильной цитоплазмой, содержащей глобулярные включения, и эксцентрично расположенным ядром с видимыми ядрышками и везикулярным хроматином [187], чаще она представляет собой мелко круглоклеточную опухоль, гистологически неотличимую от изоморфноклеточной глиобластомы или ПНЭО ЦНС. Заподозрить АТРО помогают возраст младше 5 лет, парастволовая локализация в перимедулярной цистерне или в мостомозжечковом углу, а также нейровизуализационные данные. Особенностями АТРО на МРТ являются кровоизлияние в опухоль [160] и контрастное усиление в виде извитого ободка, окружающего кисту или некротические участки [311].
До введения в рутинную практику иммуногистохимического исследования опухоли с антителом INH (Clone MRQ-27) или Anti-BAF47 BD Transduction Laboratories Clone 25/BAF47 [151, 204] некоторое количество АТРО ошибочно диагностировалось как глиобластомы или ПНЭО ЦНС. В последнее время отличить вышеперечисленные опухоли от АТРО не составляет большого труда по наличию тотальной ядерной экспрессии INI1 (BAF47) в любой супра- и инфратенториальной опухоли за исключением АТРО. При этом внутренним контролем корректной работы антитела INI1 (BAF47), которое мы используем в разведении 1:250, является присутствие экспрессии INI1 в эндотелии сосудов.
Для диагностики АТРО могут быть использованы и другие антитела: виментин, эпителиальный мембранный антиген ЕМА и гладкомышечный актин, которые экспрессируются преимущественно в крупных рабдоидных клетках. Также можно наблюдать экспрессию глиофибриллярного кислого белка и синаптофизина как в порции крупных клеток, так и в мелких недифференцированных клетках [50, 51, 187, 301]. Экспрессия виментина, гладкомышечного актина и ЕМА может отсутствовать в мелкоклеточной порции опухоли, что (особенно при положительной экспрессии синаптофизина) может привести к ошибочному диагнозу ПНЭО ЦНС, кроме того, АТРО возникают и у взрослых [27, 120, 188, 191, 238, 244, 274, 289, 290]. Поэтому на сегодняшний день «золотым стандартом» в постановке диагноза «атипическая тератоидно-рабдоидная опухоль» является иммуногистохимическое исследование опухоли с антителом IM1 (Clone MRQ-27) или Anti-BAF47 BD Transduction Laboratories Clone 25/BAF47.
Согласно текущей классификации ВОЗ опухолей ЦНС примитивная нейроэктодермальная опухоль центральной нервной системы представляет собой гетерогенную группу опухолей, состоящих из недифференцированных или низкодифференцированных клеток, способных к нейрональной/нейробластической, астроцитарной или эпендимарной дифференцировке. Опухоли, показывающие только нейрональную дифференцировку называются полушарными нейробластомами, в случае наличия ганглиозных клеток - полушарными ганглионейробластомами.
Помимо полушарных нейробластом и ганглионейробластом текущая классификация от 2007 года различает медуллоэпителиому, эпендимобластому и ПНЭО ЦНС NOS - «not otherwise specified» - «не указано иное», что является синонимом супратенториальной ПНЭО ЦНС и используется для недифференцированных или низкодифференцированных эмбриональных опухолей любой локализации в ЦНС, исключая большие полушария головного мозга [187].
Все ПНЭО ЦНС являются злокачественными опухолями и имеют как и глиобластома самую высшую IV степень злокачественности, но в то же время если для нейробластомы описаны редкие случаи созревания в более дифференцированную ганглионейробластому [12, 63, 216, 298], то прогноз при возникающих у детей младше 3 лет медуллоэпителиоме и эпендимобластоме крайне неблагоприятен [187].
В текущей классификации ВОЗ опухолей ЦНС упоминается эмбриональная опухоль с обилием нейропиля и истинными розетками (embryonal tumor with abundant neuropil and true rosettes ETANTR). Впервые описанная в 2000 году Eberhart et al. [90], эта опухоль характеризуется яркой морфологической картиной, основной особенностью которой является наличие истинных «эпендимобластических» многорядных розеток небольшого размера, разбросанных среди обильного розового матрикса нейропиля. В опухоли могут встречаться солидные участки скоплений низкодифференцированных клеток, каналы и трабекулярные структуры, подобные нервной трубке эмбриона, что делает эту опухоль очень похожей на эпендимобластому и медуллоэпителиому, а низкодифференцированные участки требуют проведения дифференциального диагноза с глиобластомой, АТРО и ПНЭО ЦНС. Именно из-за наличия истинных многорядных розеток для обозначения этой опухоли в 2010 году Paulus и Kleihues предложили более корректный термин «Embryonal tumor with multilayered rosettes» (ETMR) - эмбриональная опухоль с многорядными розетками [225]. Наличие истинных розеток делает необходимым проведение дифференциального диагноза с опухолями, клетки которых способны к построению истинных (но не всегда многорядных) розеток, к таким опухолям относятся АТРО, незрелая тератома и анапластическая эпендимома [51, 215]. Другой особенностью ETMR является амплификация локуса 19q 13.42, кодирующего микроРНК [11, 161, 230], данная амплификация может быть определена методом флуоресцентной гибридизации in situ и не встречается ни в каких других опухолях с истинными розетками кроме ETMR [107, 230].
Наиболее удобным и простым в применении в рутинной практике является предложенное нами иммуногистохимическое исследование опухоли с антителом LIN28A Cell Signaling Inc., которое позволяет безошибочно отличить ETMR от любой другой опухоли по наличию выраженной экспрессии LIN28A в цитоплазме опухолевых клеток [162], хотя некоторые авторы описывают экспрессию LIN28A в глиобластомах со стволовыми клетками и сообщают о роли LIN28A в процессе трансформации нормальной клетки в агрессивную глиальную опухолевую клетку [193].
Наблюдая наличие амплификации на локусе 19ql3.42 и выраженной цитоплазматической экспрессии LIN28A в одном случае эпендимобластомы и медуллоэпителиомы мы пришли к выводу о том, что эпендимобластома, медуллоэпителиома и эмбриональная опухоль с многорядными розетками составляют единую нозологическую единицу и должны быть выделены в будущей классификации ВОЗ опухолей ЦНС в отдельную группу ПНЭО ЦНС, возникающую преимущественно у детей младше 3 лет и характеризующуюся неблагоприятным прогнозом [13, 163].
Иммуногистохимическое выявление мутантных протеинов К27М, IDH1 и BRAF в глиобластомах
Метиляционный анализ выявил преимущественно гипометилированный генотип в детских опухолях - в 131 случаях, в 5 случах - гиперметилированный генотип, в 100% случаях сочетающийся с мутацией гена IDH1. Во взрослых глиобластомах нормометилированный генотип был выявлен в 48 опухолях и гиперметилированный генотип в 29 глиобластомах, что четко коррелировало с отсутствием или наличием мутации генаДЖ/.
Ген MGMT был метилирован в 28 опухолях у детей, чей возраст был старше 8 лет. Метилирование гена MGMT в 100% случаев сочеталось с мутацией гена IDH1 и в 73% случаев - с мутацией G34R/V, 11 детских глиобластом (17%), в которых не было выявлено вышеописанных мутаций, имели метилированный ген MGMT, также в одном случае было выявлено сочетание мутации К27М и метилирования гена MGMT. У взрослых глиобластом был выявлен 34 опухолях (44%), как и в детской серии метилирование гена MGMT в 100% сочеталось с мутацией гена IDH1, также метилированный ген MGMT был выявлен в 5 опухолях с отсутствием мутации гена IDH1. Статистический анализ выживаемости нейрохирургических больных с глиобластомами Для анализа общей выживаемости был использован метод Kaplan-Meier. Общая выживаемость была подсчитана от даты установления диагноза до смерти от прогрессии основного заболевания (пациенты, погибшие по другим причинам не включались в исследование) или до даты сбора последних катамнестических данных.
Безрецидивная выживаемость была определена как промежуток времени от даты операции хирургического удаления опухоли до даты прогрессии заболевания или в случае отсутствия прогрессии заболевания до даты сбора последних катамнестических данных.
Унивариантный анализ показал, что статистически значимым для общей выживаемости детских глиобластом является наличие амплификации и тип выявленной мутации: наличие мутации гена H3F3A в варианте К27М или в варианте G34R/V, а также наличие мутации гена IDH1. 1-летняя общая выживаемость составила: для детских глиобластом с мутацией гена H3F3A вариант К27М - 47%, для детских глиобластом с мутацией гена H3F3A вариант G34R/V - 74%, для детских глиобластом с мутацией гена IDH1 - 100% и для детских глиобластом без мутаций генов H3F3A или IDH1 -63%. 2-летняя общая выживаемость составила: для детских глиобластом с мутацией гена H3F3A вариант К27М - 8%, для детских глиобластом с мутацией гена H3F3A вариант G34R/V - 44%, для детских глиобластом с мутацией гена 207 ЮНІ - 100% и для детских глиобластом без мутаций генов H3F3A шш ЮНІ-31%. 3-летняя общая выживаемость составила: для детских глиобластом с мутацией гена H3F3A вариант К27М - 4%, для детских глиобластом с мутацией гена H3F3A вариант G34R/V - недостаточно данных для определения, для детских глиобластом с мутацией гена ЮНІ - 100% и для детских глиобластом без мутаций генов H3F3A или ЮНІ - 19%.
5-летняя общая выживаемость составила: для детских глиобластом с мутацией гена H3F3A вариант К27М - 0, для детских глиобластом с мутацией гена H3F3A вариант G34R/V - недостаточно данных для определения, для детских глиобластом с мутацией гена ЮНІ - недостаточно данных для определения и для детских глиобластом без мутаций генов H3F3A или ЮНІ - 13%.
Для мультивариантного анализа была использована регрессивная модель Кокса. Мультивариантный анализ показал, что негативное влияние на прогноз при детских глиобластомах оказывают следующие факторы: наличие мутации гена H3F3A вариант К27М, наличие амплификации любого из перечисленных (EGFR, PDGFRA, MYC/MYCN, CDK/CCND) онкогенов, а также срединная и глубинная локализация опухоли (в таламусе, стволе головного мозга и спинном мозге), в то время метилированный ген MGMT позитивно влияет на прогноз заболевания.
Основываясь на результатах, полученных нами при цитогенетическом, мутационном и метиляционном анализе, а также оценке показателей общей выживаемости для глиобластом у детей и взрослых мы разработали молекулярную классификацию глиобластом, отдельно для каждой возрастной группы, разделив глиобластомы в в зависимости от наличия или отсутствия ключевых часто возникающих мутаций генов H3F3A и IDHL
Первую группу детских глиобластом составили опухоли с мутацией гена H3F3A, выявленной в 50% опухолей. В этой группе были выделены две четко отличные друг от друга подгруппы в зависимости от варианта мутации гена H3F3A. Данные подгруппы различались по локализации опухолей (строго полушарных при варианте G34R/V и глубинно-срединных при варианте К27М), статусу метилирования гена MGMT и показателям общей выживаемости (более благоприятным при варианте G34R/V). Наличие мутации гена ЮНІ было отличительной особенностью группы взрослых глиобластом, которые, помимо мутации гена IDH1, характеризовались гиперметилированным генотипом и строгой локализацией в больших полушариях.
Характерными особенностями детских и взрослых глиобластом с отсутствием мутаций генов H3F3A и ЮНІ являлась высокая частота встречаемости цитогенетических аберраций. Детские глиобластомы с отсутствием мутации гена H3F3A имели больший по сравнению с глиобластомами с мутацией гена H3F3A процент амплификации генов EGFR и PDGFRA, чаще встречались у них гомозиготная делеция гена CDKN2A и потеря хромосомы 10q. В группе взрослых глиобластом с отсутствием мутации гена ЮНІ наблюдалась похожая ситуация: амплификация гена EGFR была обнаружена в 42% случаев против 7%, выявленных в группе с мутацией гена IDHL Гомозиготная делеция гена CDKN2A и потеря хромосомы 10q также были выявлены в большем проценте случаев в группе с отсутствием мутации гена ЮН7. Сравнение количества цитогенетических аберраций в детских и взрослых глиобластомах без мутаций генов H3F3A и ЮНІ показало, что в группе детских глиобластом преобладали амплификации генов MYC/MYCN, PDGFRA и CDK/CCND. В то время как взрослые глиобластомы чаще показывали амплификацию гена EGFR, гомозиготную делецию гена CDKN2A и потерю хромосомы 10q.
Изучение цитогенетических аберраций и впервые описанной нами мутации гена H3F3A, а также мутации гена ЮНІ и статуса метилирования гена MGMT обогатило нас новыми знаниями в области патогенеза детских глиобластом. Исследование мутации гена H3F3A на большой группе детских глиобластом позволило сравнить варианты мутации гена H3F3A (К27М и G34R/VJ с локализацией опухоли и определить прогностическое значение каждого типа мутации. Информация о наличии или отсутствии мутации гена H3F3A будет способствовать более дифференцированному подходу к лечению глиобластом у детей и возможной в будущем таргетной терапии препаратами, действие которых направлено на упорядочение ремоделирования хроматина и/или посттрансляционную модификацию гистонов. Выявление мутации гена H3F3A вариант К27М позволит на данном этапе использовать высокодозную химиотерапию с аутологичной поддержкой стволовыми клетками для лечения наиболее генетически неблагоприятного варианта глиобластомы, не опасаясь выраженных осложнений данной терапии. На сегодняшний день становится очевидным, что детские глиобластомы с отсутствием мутации гена H3F3A и неметилированным геном MGMT не отвечают на терапию Темозоломидом, вероятно, такие опухоли должны быть включены в проспективные клинические исследования с использованием препаратов-ингибиторов RTK/mTOR, в то время как в лечении глиобластом с редко возникающей мутацией гена BRAF могут быть использованы препараты-ингибиторы BRAF, а опухоли с мутацией гена ЮНІ, а также с мутацией гена H3F3A вариант G34R/V, часто сочетающиеся с метилированным геном MGMT должны быть лечены с применением Темозоломида или ингибитором AGI-5198, действующим яаЮНІ R132H.