Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1 Универсальный механизм повреждения биомембран - перекисное окислемие липидов. Особенности процесса ПОЛ при наркотической патологии 10
1.2. Молекулярные механизмы токсического действия этанола . 17
1.3. Патологии печени как следствие наркологических заболеваний 26
1.4. Влияние различных антиоксидантов на окислительный стресс и патологии печени в наркологической практике 34
1.5. Вицинальные дитиогликоли и их применение в медицине 37
Глава 2. Материалы и методы 42
2.1. Моделирование острой и хронической интоксикации наркотическими анальгетиками или этанолом 42
2.2 Методы статистической обработки результатов эксперимента 44
Глава 3. Результаты исследования 47
3.1. Исследование острой токсичности унтнопарег os в опыте in vivo 47
3.2. Влияние унитиола на ПОЛ и уровень основных компонентов неферментативной АО защиты у крыс в условиях острой и хронической интоксикации морфином 49
3.3. Коррекция состояния ПОЛ и уровня основных компонентов неферментатишюй АО защиты у крыс в условиях постинтоксикатдиоиного периода при хроническом введении этанола . 55
3.4. Исследование влияния приема унитиола для снятия проявлений интоксикации при бытовом употреблении слабоалкогольных напитков . 59
3.5. Ограниченное клиническое исследование влияния унитиола при пероралыгом приеме в период детоксикации в условиях наркологического стационара. 72
Глава 4. Обсуждение результатов 80
Выводы 91
Список литературы 93
- Молекулярные механизмы токсического действия этанола
- Влияние различных антиоксидантов на окислительный стресс и патологии печени в наркологической практике
- Моделирование острой и хронической интоксикации наркотическими анальгетиками или этанолом
- Влияние унитиола на ПОЛ и уровень основных компонентов неферментативной АО защиты у крыс в условиях острой и хронической интоксикации морфином
Введение к работе
Наркомании и токсикомании, как понятия в современном смысле этих слов, приобрели социально-медицинскую значимость лить в последние десятилетия. Однако, широкое распространение и доступность наркотических средств, а также постоянное пополнение списка химических соединений, способных вызвать эффект эйфории за счет «проб и ошибок» подростков, представляет собой одну из самгэтх серьезных проблем, стоящих перед человечеством,
Не менее трагично выглядит ситуация с распространением заболеваний, связанных с чрезмерным употреблением этанол со держащих напитков. Особенно это относится к употреблению низкосортных и содержащих большое количество токсичных примесей спиртных напитков.
В «Государственном докладе о состоянии здоровья населения Российской Федерации в 2000 г.» зафиксировано, что «Алкогольная ситуация в стране на протяжении длительного времени весьма неблагополучна,.., среднегодовое потребление алкоголя составляет около 14 л на человека, тогда как ВОЗ оценивает ситуацию как опасную при 8 л в год». Комиссия по здрав оохранениго Государственной Думы РФ считает эту цифру заниженной, поскольку она не учитывает дополнительное потребление 6 л алкоголя из «подпольных источников». При этом известно, что потребление более 12 л алкоголя в год приводит к отчетливому увеличению частоты формирования генетических дефектов у населения [ А.И, Хазанов, 90].
Эффективные методы и средства лечения наркоманий и алкоголизма могут быть осуществлены лишь на основе целенаправленной коррекции биологических нарушений, составляющих патогенетическую основу заболевания [ И.П. Анохина, 6]. Такой подход даст возможность предупредить и последствия злоупотребления психоактивными веществами.
Токсические эффекты наркотических средств и алкоголя многообразны, однако есть и общие звенья в патогенезе заболеваний, вызванных употреблением этих веществ. К ним относятся каскад взаимосвязанных и взаимообусловленных нарушений в системе катехоламиновой регуляции и нейромеднации [И.П. Анохина, 7], а таюке цепь нарушений, связанных со свободнорадикальным, в
частности, гтсрекисным, окислением липидов. Достаточно детально изучен свободнорадикальпый механизм повреждения биомембран при алкогольной интоксикации (Л.Ф. Панченко, A.M. Герасимов, В.Д. Антоненков, СВ. Пирожков, 1981-1990 г.г.) и доказан для ряда химических и лекарственных препаратов [74]. Из сообщения Heron et al., (1982) известно, что наркотические анальгетики влияют на структуру и липидный состав нейроцитов, что лежит в основе одной из теорий развития толерантности и зависимости к морфину на уровне мембраны [136]. В последнее десятилетие изучалась способность наркотических веществ и их метаболитов влиять на характер процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) биомембран in vivo при поступлении в организм наркотических веществ [А.Г. Калинина. СВ. Пирожков 50]. Исследованы также состояние эндогенной аптиоксидантной (АО) защиты организма в эксперименте и в клинике, а также попытка коррекции окислительного стресса при острой и хронической интоксикации морфином и промедолом с помощью а-токоферола [84, 85].
К эффективным средствам, противодействующим патологически возрастающей скорости ПОЛ, относятся вещества природного и синтетического происхождения под общим названием антиоксиданты. Накоплен немалый положительный опыт применения их в медицинской практике в качестве лекарственных и вспомогательных средств для лечения заболеваний, сопровождающихся окислительным стрессом [9, 11, 14]. Тем не менее, в организме человека про- и аитиоксидантные системы достаточно сложны и полифункциональны, а. токсические эффекты алкоголя и наркотических веществ разнообразны. Поэтому не всегда проведение аптиоксидантной терапии оказывается достаточным для одновременного повышения устойчивости организма к прооксидантным воздействиям и купирования токсического влияния психоактивных веществ.
Задача поиска средств, которые сочетали бы в себе одновременно аитиоксидантные и антитоксические свойства, представляется актуальной. Для продвижения в ее решении нами предложено пероралыюе введение унитиола, представителя вициналъных дитиогликолей, группы химических соединений, к которым относятся некоторые известные инъекционные лекарственные средства, например, унитиол и дикаптол.
Химические свойства вицинальных дитиогликолей (ВД), в которых тиоспиртовые группы связаны с соседними атомами углерода, дают основания предполагать определенную перспективу их применения в наркологии. На это имеются a priori две причины. Во-первых, в медицинской литературе имеются указания на антиоксидантные свойства унитиола и других ВД, что важно при окислительном стрессе, сопровождающем наркотическую интоксикацию [Л.Г. Голота, 35]. Во-вторых, химическая структура ВД даёт основания рассчитывать на их активность по отношению к карбонильным соединениям, некоторые из которых, например, ацетальдегид, являются основными токсическими метаболитами этанола.
Для экспериментальной оценки перспективности перорального применения этого класса веществ в наркологической практике необходимо было выбрать один из ВД. По ряду причин, которые будут изложены ниже, мы остановились на унитиоле. Здесь лишь отметим, что синтез унитиола освоен отечественной промышленностью начиная с 50-х годов прошлого столетия (его синтезировал впервые В.Е. Петру нькин), а препарат (5%-ный раствор унитиола для инъекционного введения) знаком наркологам, поскольку ранее применялся в составе детоксикационных мероприятий при купировании тяжёлых абстинентных состояний и алкогольного делирия.
Мы предположили, что применение унитиола per os более перспективно, чем инъекционное введение, по крайней мере, при острой интоксикации этанолом. Основанием для этого являются исследования метаболических путей этанола и выявление основных органов-мишеней, проведённые в последние десятилетия [ИЛ. Анохина, Н.Н Иванец, В.Я Дробышсва, 5].
ЦЕЛЬЮ настоящей работы явилось исследование мембранопротекторных и детоксицирующих свойств унитиола при пероральном применении в условиях экспериментальной наркотической патологии и ограниченные испытания эффективности препарата в условиях клиники.
В связи с целью были определены и решены следующие ЗАДАЧИ:
1. Исследовать влияние унитиола на процессы ПОЛ и систему АО резистентности животных при экспериментальной интоксикации этанолом.
Определить параметры ПОЛ, АО защиты организма при бытовом приеме слабоалкогольных напитков и влияние на иих перорального приема унитиола в постинтоксикационный период,
Исследовать влияние унитиола на течение процесса ПОЛ, антиоксидантний статус организма и активность ферментов-маркёров патологии печени при купировании алкогольного абстинентного синдрома в условиях наркологического стационара
4. Изучить мембранопротекторные свойства унитиола при
экспериментальных острой и хронической интоксикации морфином, в частности,
определить влияние препарата на скорость реакций ПОЛ; оценить степень влияния
унитиола на систему эндогенной антиоксидантной резистентности.
Исследовать острую токсичность унитиола при пероральном применении в опыте in vivo.
Оценить диапазон эффективных доз для дезинтоксикационной терапии и разработать методические рекомендации по применению унитиола per os в составе средств купирования острой алкогольной интоксикации.
Научная новизна. Впервые проведены исследования перорального применения унитиола, известного в медицинской практике в виде 5%-ного раствора унитиола для инъекций, в наркологических целях. При этом обнаружены:
выраженные мембранопротекторные свойства унитиола при его пероральном применении в условиях острой и хронической экспериментальной наркотической интоксикации;
выраженные мембранопротекторные свойства унитиола и детоксицирующий эффект при постинтоксикационном алкогольном состоянии (ПАС) и при интоксикации слабоалкогольными напитками
Впервые установлено, что пероральное введение унитиола больным алкоголизмом при проведении дезинтоксикационной терапии (в первый день пребывания в наркологическом стационаре) в сочетании с последующей стандартной терапией достоверно улучшает ряд биохимических показателей по сравнению с показателями больных, получивших только стандартную терапию.
Сделан вывод о том, что пероралышй путь введения унитиола названный в работе «циклом пероральной этанолы-ю-альдегидной детоксикации», быстро ведёт
к ускоренному купированию соматических и биохимических проявлений АЛС и дано расширенное объяснение молекулярного механизма антиоксидантного действия унитиола.
Научно-практическая значимость работы. Выполненные исследования позволяют расширить опенку унитиола как средства, применяемого в составе общей дстоксикационной терапии. Новый путь введения препарата ведёт к значительному усилению его известного действия и раскрывает дополнительные возможности использования субстанции в медицинской практике, в частности, в наркологии, с целью купирования проявлений наркотической интоксикации. Данные работы дают основания для разработки перорального лекарственного средства на основе унитиола, предназначенного для повышения эффективности существующей терапии. Рекомендуется также разработка пероральных средств более широкого применения, чем лекарственные, в частности, биологически активных добавок на основе унитиола, для приёма в целях снятия симптомов постинтоксикационного алкогольного состояния, снижения токсических эффектов употребления или злоупотребления алкогольными напитками.
Опыт перорального применения и спектр коррекции биохимических показателей с помощью унитиола обобщён в Методических рекомендациях «Пероральное применение унитиола в составе детоксикационных мероприятий при купировании алкогольного абстинентного синдрома», разработанных коллективом авторов Московского научно-практического центра профилактики наркоманий Комитета здравоохранения Москвы и Московского городского наркологического диспансера №1.
По части материалов работы произведено патентование. Роспатентом РФ выдан патент № 2157647 на изобретение «Пищевая добаяка и способ её получения, биологически активная добавка к пище и способ её получения, пищевой продукт и способ его получения» с приоритетом от 29.12.1999 г.
Подана заявка № 2003119563 па получение патента РФ на изобретение «Средство для снижения скорости течения, предупреждения развития, предупреждения возникновения патологических процессов, вызываемых употреблением этанола и/или веществ, обладающих аддитивным потенциалом».
Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, резулг/гатов собственных исследований и обсуждения результатов, выводов, списка цитируемой литературы. Текст диссертации занимает 107 страниц машинописного текста. Библиографический указатель включает 200 источников, в том числе 96 отечественных и 104 зарубежных. Работа иллюстрирована 14 таблицами и 43 рисунками.
Апробация работы. Апробация диссертации состоялась на заседании Ученого совета Московского научно-практического центра профилактики наркомании Комитета здравоохранения г. Москвы. Основные результаты работы доложены и обсуждены на заседании Проблемной комиссии по медико-биологическим проблемам наркологии при НИЦ наркологии МЗ РФ. Большая часть основных результатов доложена на 1-й Международной конференции «Высокие медицинские технологии XXI века» (Испания, 2002).
По материалам диссертации опубликовано 4 научных работы, получен 1 патент-.
Выполнение экспериментальной части настоящей работы начато в ООО «Биохимсинтез» в 2000 году, продолжено и завершено в Московском научно-практическом центре профилактики наркоманий Комитета здравоохранения города Москвы при сотрудничестве с лабораторией биохимии Национального научного центра наркологии МЗ РФ. Исследования выполнены впервые.
Молекулярные механизмы токсического действия этанола
Источник эндогенного этанола - эндогенный ацетальдегид (Ац), который образуется, главным образом, в результате декарбоксилирования пирувата при участии пируватдегидрогеназпого комплекса и вследствие расщепления треонина и дезоксирибозо-5-фосфата, катализируемого альдолазами.
Эндогенный Ац превращается в этанол в обратимой реакции, катализируемой алкогольдегидрогеназой (АДГ): АДГ является НАД-зависимым ферментом, содержится, в основном, в печени (95%), а также мозге, почках, кишечнике, лёгких, фермент локализован главным образом в цитозоле клетки. В активный центр каждого мономера АДГ входят атом цинка в комплексе с тиогруппами 2 молекул цистеина. Сродство АДГ к этанолу сравнительно невелико, при физиологических условиях равновесие реакции сдвинуто вправо.
Многие специалисты (см., например, Корнеев А.А. с соавт., 1994) придерживаются точки зрения, что эндогенный этанол является подвижным челночно-транспортным депо для Ац. Этанол легко проходит через мембраны клеток и значительно менее токсичен, чем Ац. В то же время Ац в небольших физиологических концентрациях в митохондриях необходим как позитивный регулятор транспорта электронов в дыхательной цепи [54]. При более высоких концентрациях в клетке экзогенных этанола и ацетальдегида, соответствующих для этанола содержанию в крови 0,7—2 г/л или 15—43 ммоль/л. тормозится транспорт электронов в дыхательной цепи, т.к. Ац связывает и блокирует убихинон 0. Нарушения в дыхательной цепи возникают в основном из-за угнетения экзогенным ацетальдегидомКАБН-дегидрогеназы.
Экзогенный этанол окисляется как минимум тремя путями и превращается в Ац. Цитозольная АДГ катализирует превращение в АЦ примерно 80% экзогенного этанола. Второй путь окисления экзогенного Э (10-20%) протекает при участии цитохрома Р-450 (изофермент Р-450 Л Ef) и реализуется в гладком эндоплазматическом ретикулуме клеток печени при участии кислорода и NADPH СН3 СН2 ОТТ + NADPH + Н+ - СН3С О Н + NADP+ + 2 Н20
Данная микросомальная этанол окисляющая система (МЭОС) является, во-первых, индуцибельной (индукторы - Э, другие спирты, лекарства типа барбитуратов и др.). При хроническом алкоголизме окисление этанола ускоряется на 50-70% за счет индукции цитохрома Р-450 с гипертрофией эндоплазматического ретикулума. Одновременно ускоряется биотрансформация лекарственных веществ при участии цитохрома Р-450 2ЕЬ обладающего специфичностью к субстрату. Во-вторых, величина константы Михаэлиса К цитохрома Р-450 около 9-15 ммол/л, или 0,4-0,7 г/л. Соответствующие величины для АДГ меньше (около 2 ммол/л или 0,2 г/л). Таким образом, принципиальные отличия МЭОС от АДГ (индуцибельность, высокие значения Км, использование восстановленной формы кофермента NADPH) обеспечивает ее включение для окисления экзогенного этанола при его достаточно высокой концентрации в условиях гиперпротонемии (за счет параллельного и опережающего функционирования АДГ) или при хроническом употреблении этанола. Индуцибельность питохрома Р-450 является одной из причин возникновения толерантности у больных к этанолу. Кроме основной реакции, цитохром Р-450 катализирует также образование АФК, которые активизируют перекисное окисление липидов (ПОЛ) в печени и других органах. Одновременно включается еще один минорный путь окисления экзогенного этанола (2%) за счет образующегося из различных источников пероксида подо рода
Наиболее активно окисление этанола при участии каталазы происходит в пероксисомах клеток. Образовавшийся из эндо- или экзогенных источников Ац подвергается дальнейшему окислению до уксусной кислоты. При этом возможны две реакции. Первая реакция является минорной и протекает при высоких концентрациях Ац. образующегося из экзогенного этанола, и катализируется индуцибельной альдегидоксидазой - FAD-зависимым ферментом печени При этом генерируется не только пероксид водорода, но и другие активные формы кислорода, что приводит к активации ПОЛ. Основной является другая необратимая реакция, катализируемая NAD-зависимой ацетальдегиддегидрогеназой (АцДГ) Образующая уксусная кислота при участии АТФ, KoA-SH и ацетил-КоА-синтетазы превращается в ацетил-КоА, который вступает в цитратный цикл или используется для синтеза жирных кислот, холестерина, триглицеридов (IT) и Р-оксибутирата. АцДГ представлена в клетках разных органов (почки, эпителий, слизистая желудка и кишечника, эритроциты), но больше всего ее в печени (40% Ац метаболизируется в печени). Фермент обладает широкой субстратной специфичностью, катализируя окисление разных альдегидов, содержит цинк и значительные количества цистеина. Для проявления активности необходимы тиогруппы. Существует несколько изоферментов АцДГ печени человека. Из них надо выделить митохондриальнуго АцДГ с высоким сродством к Ац и цитоплазматическуго АцДГ с несколько меньшим сродством. Последняя индуцируется Э и некоторыми ксенобиотиками. Обе формы, особенно первая, имеют наибольшее значение в окислении Ац и обусловливают 40-80% от общей ферментативной активности клетки в отношении АцДГ. При хроническом алкоголизме, для которого характерно повышение концентрации Ац в крови и в цитозоле клетки, возрастает активность цитоплазматической АцДГ. При ожирении и циррозе печени активность отдельных изоформ АцДГ снижается. АцДГ эритроцитов идентична цитоплазматичеекому ферменту гепатоцитов. Исследователи сходятся в оценке, что в цитозоле неповреждённых алкоголем гепатоцитов находится около 80% АДГ и 20% АцДГ, а в митохондриях — 20% АДГ и 80% АцДГ от активности ферментов во всей клетке; в цитозоле преобладает активность АДГ [89]. В митохондриях потенциальная активность АцДГ примерно в 60 раз больше активности АДГ. При поступлении в клетку экзогенного этанола, который легко проходит через мембраны, максимальная концентрация Ац создается в цитозоле, а наиболее низкая - в матриксе митохондрий. Это связано с указанными различиями в распределении АДГ и АцДГ внутри клетки и с малой проницаемостью мембран для Ац. Гели доля экзогенного этанола невелика (0,2-0,5 г/кг), то умеренное повышение концентрации Ац в клетке не приводит к токсическим эффектам, в том числе к ингибированию NADH-дегидрогеназы [88], Ац и этанол быстро и согласованно окисляются в цитозоле и митохондриях с образованием NADH, уксусной кислоты, ацетил-Ко А и АТФ. Эти процессы сопровождаются усилением поглощения кислорода тканями.
Влияние различных антиоксидантов на окислительный стресс и патологии печени в наркологической практике
Безуглеводистый (углеводцефицитный, или десиализированный) трансферрин (десиалотрансферрин) - соединение трансферрина с ацетальдегидом, которое имеет не только диагностическое значение, но и участвует в процессе накопления железа в печени. Десиалотрансферрин выявляют у 70-е-90% лиц, употребляющих алкоголь в количестве не менее 60 г этанола в день в течение 1 недели. Роль этого соединения в развитии патологии печени особенно велика на фоне ХАИ, сопровождающейся значительной активацией ПОЛ и генезом свободных радикалов. Поскольку железо является основным индуктором процесса ПОЛ, применение препаратов, удаляющих (связывающих, хелатиругощих) железо показано. Показаны также и средства для удаления ацетальдегида, что препятствует образованию десиалотрансферрина. Эти данные исследований дополнительно указывает на двойную целесообразность предлагаемого нами перорального применения вицинальных дитиогликолеи для снижения тяжести ХАИ и ПАС. В мировой практике до настоящего времени основными методами определения употребления алкоголя и/или наркотических средств оставались иммунохимические методы, позволяющие выявлять метаболиты основных классов вышеуказанных веществ в биологических жидкостях. В последние годы разрабатываются новые методы анализа, позволяющие диагностировать аддиктивное состояние в отдалённые сроки после последнего употребления наркотика или злоупотребления этанолом. Реализация метода основана па проведении основных стадий твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА), включая сорбцию антигена на полистирол ьный планшет; нанесение анализируемых образцов; выявление образовавшихся иммунных комплексов с помощью антивидовых антител с последующим проявлением ферментативной реакции; измерение оптической плотности на спектрофотометре [66].
В последние годы внимание исследователей гепатологов вновь обратилось к ПОЛ как к ведущему механизму повреждения ткани печени. Это вызвано, во-первых, накоплением материала по взаимоотношению окислительного стресса, продукции цитокинов. программированной гибели клеток и фиброгенеза, которые однотипны для гепатопатий различной этиологии. Во-вторых, прогрессирует понимание сути патогенеза алкогольной болезни печени и неалкогольного стеатогепатита - нозологических форм, при которых ПОЛ принадлежит ведущая роль. В-третьих, с появлением новых маркёров открылись возможности изучения процессов ПОЛ in vivo [22]. Ряд исследователей отмечает, что этанол-индуцированный окислительный стресс вносит вклад в иммунный ответ у алкоголиков, причём за это ответственны антигены, отличные от перекисей липидов [156].
Развитие окислительного стресса связано с метаболизмом жирных кислот в печени и образованием активных форм кислорода (АФК). Накопление жира в гепатоцитах может быть следствием: 1) повышения поступления в печень свободных жирных кислот (СЖК); 2) снижением скорости fi-окисления СЖК в митохондриях; 3) избыточного синтеза СЖК; 4) снижения синтеза или секреции липопротеинов очень низкой плотности (ЛГІОНГІ).
Свободные или неэстерифицированные жирные кислоты либо поступают в печень из тонкой кишки или жировой ткани, либо синтезируются непосредственно в печени. Затем СЖК либо эстсрифицируются с образованием триглицеридов, либо проникают в митохондрии при участии карпитинпальмитоилтрансферазы-1. Этанолу принадлежит важная роль в нарушении обмена СЖК. Его окисление приводит к повышению расхода НАД и увеличению соотношения в пользу его восстановленной формы НАД«Н. Это ведёт к усилению з-стерификации жирных кислот и синтеза триглицсридов, что служит начальным этапом развития как гиперлипидемии, так и жировой дистрофии печени, Нарастание концентрации НАД П сопровождается снижением скорости [1-окисления жирных кислот, что также ведет к их отложению в печени.
Однако ключевые патоморфологические признаки, присущие АБП, могут наблюдаться при патологиях печени нсалкогольной этиологии, например, при неалкогольном стсатогспатитс [47]. При этом развитие патологии проходит через те же стадии, что и при АБП: от простого стеатоза до стеатогепатита, фиброза и исхода в цирроз. Ряд исследователей считает, что эффектами ПОЛ можно объяснить основную часть наблюдаемых при стеатогепатите гистологических изменений [173, 22]. ПОЛ с повреждением мембран приводит к некрозу клеток и формированию гигантских митохондрий. Альдегиды, как экзогенные, так и продукты ПОЛ, активируют звёздчатые клетки, а также вызывают перекрёстное связывание цитокератинов с формированием телец Маллори и стимулированием хемотаксиса нейтрофилов.
Недавние исследования на алкоголиках и экспериментальных моделях на животных указывают, что Ац, первый метаболит этанола, и альдегидные продукты переокисления липидов могут связываться с белками в тканях с образованием устойчивых аддуктов. Исследования таких аддуктов в гепатоцитах алкоголиков с ранней стадией гистологического повреждения печени показывает, что образования аддуктов могут играть важную роль в последовательности событий, ведущих к алкогольному повреждению печени. Возможно вмешательство в функции клеток, сопряжённое со стимуляцией фиброгенеза и иммунологическим ответом. Показано, что аутоантитела по отношению к различным типам аддуктов ассоциированы со степенью поражения печени у алкоголиков. Высокожирпая диета и/или добавки железа совместно с этанолом могут увеличивать количество альдегид-производных эпитопов и ускоряют фиброгенез в печени [163]. В процессе регенерации восстановленных форм коферментов НАД и ФАД происходит перепое электронов дыхательной цепи митохондрий, при этом протоны перемещаются из митохондриального матрикеа в межмембранное пространство. При этом создаётся высокий электрохимический потенциал и происходит фосфорилирование АДФ до АТФ. Небольшая часть электронов непосредственно реагирует с кислородом, что ведёт к синтезу АФК. Под воздействием ряда факторов «разобщения окисления и фосфорилиропания», к которым относятся, в частности, железо, оксид азота, медь, этанол, многие лекарственные препараты, наркотические вещества, происходит образование избытка АФК, который, в свою очередь, ведёт к повреждениям ДНК митохондрий, усугубляющим нарушения функций дыхательной цепи. «Раскручивание» этой спирали окислительного стресса углубляет патологические процессы в ткани печени.
Ряд исследователей полагают, что наличие окисляемого жира в печени является достаточным, чтобы выступить в роли триггера каскада ПОЛ [172]. В то же время у многих пациентов стеатоз печени никогда не прогрессирует до стадии некротически-воспалительных изменений и фиброза. Это означает, что помимо стеатоза («первого толчка») для развития стсатогепатита требуются и другие факторы («второго толчка»), среди которых гепатологи основными считают химические соединения, разобщающие окисление и фосфорилирование.
Моделирование острой и хронической интоксикации наркотическими анальгетиками или этанолом
Для сравнения выборок ниже приводится оценка доверительной вероятности для ошибки первого рода по критерию Колмогорова-Смирнова для гипотезы о том. что представленные наблюдения в сравниваемых выборках принадлежат одной совокупности. Приводятся также: значение средних в каждой сравниваемой группе, стандартные отклонения, максимальные положительная и отрицательная разности для эмпирических функций распределения. Вычисления производились с помощью программы Statistica.
При сравнении средних, как и всегда в анализе данных эксперимента, очень полезна визуализация данных. С этой целью мы используем применяемые в математической статистике диаграммы размаха, точнее категорированные диафаммы размаха. Сам термин «диаграммы размаха» (их ещё называют графиками «ящик-усы») был введён Тьюки в 1970 г. На графиках изображают диапазоны значений выбранной переменной, построенные отдельно для каждой фуппы наблюдений, определяемой значениями категоризующей или фуппирующей переменной (например, номером экспериментальной группы). Чрезвычайно удобно для визуализации данных, что на одном графике можно представить более одной зависимой переменной для сравнения распределений результатов соответствующих измерений по группам. Поскольку на диаграмме размаха представлены сведения о минимальном и максимальном значениях в выборке, медиана выборки, процентили (как правило, мы применяли квартили), то она визуально даёт значительно больше информации, чем ранее применявшиеся столбчатые диаграммы. На каждой диаграмме размаха внизу рисунка справа указаны сведения о выбранной процентили и т.д. Горизонтальные отрезки прямых обозначают min и max значения наблюдаемой величины, медиана выборки - маленький прямоугольник внутри большого прямоугольника, большой прямоугольник - границы измерений между 25 и 75 процентилями.
Перед выполнением экспериментальной части работы был произведен расчет доз унитиола, предполагаемых к использованию в опытах на животных. Были таюке учтены рекомендации по пероральному приему уиитиола людьми в более ранних исследованиях отечественных ученых.
С нашей точки зрения, количество препарата должно соотноситься с количеством карбонильных соединений, циркулирующих в организме при введении и последующем метаболизме этанола. С учётом массовых соотношений различных метаболитов, фактически необходимо принять во внимание количество ацеталъдегида. Известно, что в организме здорового человека в час окисляется 7-9 г этанола. При алкогольной интоксикации порядка 100-И 50 г этанола в текущий момент в кропи циркулирует 20-50 мг ацетальдегида. С учетом молярных и массовых соотношений (молекулярная масса унитиола примерно в два раза больше молекулярной массы ацетальдегида) можно принять, что необходимая доза унитиола может составлять 100- 500 мг субстанции для однократного приёма.
Опираясь на эту оценку диапазона дозировки субстанции унитиола при интоксикации этанолом, мы приняли решение в эксперименте при интоксикациях наркотическими анальгетиками оставаться примерно в тех же диапазонах количества применяемого в эксперименте препарата.
Несмотря на длительный срок применения унитиола в медицинской практике, пероралыюе использование этого препарата началось недавно.
Российская военно-медицинская Академия (г. Санкт-Петербург) провела в 2001 году исследование методов лечения острых пневмоний (ОП) при наличии дефицита массы тела (ДМТ) у военнослужащих Северо-Кавказского военного округа. С этой целью дополнительно к стандартной терапии испытуемые получали целый ряд препаратов: «СОДИКОР», «Витатресс». «Ретаболил», Мстилурацил, «Нуруфлекс» а таюке и унитиол перорально в виде водного раствора, дважды в день по 250 мг в приём в пересчёте на вес субстанции. Объектом исследования явились 55 больных 011 различной степени тяжести при наличии ДМТ свыше 10%. Ученые пришли к выводу о целесообразности применения предложенной схемы терапии, которая достоверно сокращала сроки лечения и полностью предотвращала развитие осложнений [79]. Данное исследование открыло путь для перорального применения унитиола в России.
Имеются также сведения о начале выпуска в 2002 г. унитиола в виде таблеток в качестве лекарственного средства, применяемого по показаниям токсикологов при интоксикациях ртутью, свинцом фирмой Heel (ФРГ). С учётом этих сведений мы сочли возможным начать проводить ограниченные испытания препарата per os при полном соблюдении требований биомедицинской этики, в частности, при строгом следовании принципу добровольности.
Пероралыгое применение унитиола в наркологической практике (в эксперименте и клинике) предпринято нами впервые, поэтому мы сочли необходимым провести предварительное исследование острой токсичности В опыте in vivo. В литературе найдены данные об определении LD50 при пероральном применении препарата в опыте на крысах [91], она составила 900 мг/кг массы. Однако указанная оценка летальной дозы показалась нам несколько заниженной. В своих исследованиях острой токсичности мы ориентировались на рекомендации, изложенные в [62]. Использовали беспородных мышей-самцов, содержавшихся в стандартных условиях вивария. Количества унитиола, вводимые животным, составили ряд: 300, 500, 1000, 1500 и 2000 мг на кг массы тела животного. Результаты исследования показали абсолютную выживаемость всех участвующих в эксперименте особей в указанном диапазоне доз. Таким образом, токсичность унитиола в пределах указанных диапазонов концентраций при пероральном введении обнаружить не удалось.
Влияние унитиола на ПОЛ и уровень основных компонентов неферментативной АО защиты у крыс в условиях острой и хронической интоксикации морфином
В последнее десятилетие исследователи, изучающие патологические процессы, сопряженные со свободнорадикальной деструкцией биомембран, проявляют интерес к синтетическим антиоксидантам. Одна из причин состоит в том, что ряд природных антиокислителей, например, а-токоферол, обладают способностью к инверсии антиоксидантной активности в прооксидантнуго при использование в лечебных целях в высоких дозах [56]. Кроме описанных ранее априорных оснований для предположений об эффективности перорального введения унитиола, мы ориентировались па имеющиеся в литературе сведения о сохранении его активности в широком диапазоне концентраций.
Первоначально задача создания препарата унитиол (его синтезировал В.Е. Петрунькин в 50-х г.г.) была вызвана нуждами токсикологии, а точнее - военной токсикологии, т.к. речь шла о создании антидота для отравляющих веществ. Его использовали сначала при интоксикациях арсенатами, а затем в случаях интоксикаций соединениями, ртути, свинца, кадмия, никеля, хрома и кобальта, а также четыреххлористым углеродом и алкилирующими веществами [46, ] 80].
Описаны варианты применения унитиола в наркологической практике при терапии неосложнённых интоксикаций тяжелой степени внутривенно и внутримышечно [18]; в случае алкогольных полинейропатий применение унитиола было многодневным и не вызывало негативных побочных эффектов. Имеются также сведения об отсутствии признаков отравления унитиолом при применении его парентерально в дозах, десятикратно превышающих терапевтическую [48].
Исследование острой токсичности унитиола. предшествующее остальной зкеперименталыюй работе, обусловлено необходимостью проверки этого показателя во всех случаях, когда химическая субстанция предполагается к использованию в качестве лекарственного средства (в соответствии с требованиями Фармакологического Комитета). Нами обнаружены сведения об LD;(j ряда ьицинальных дитиогликолей, применяемых в медицинской практике; Дитиоглицерин (2,3-димеркаптопропанол, 1-гидрокси-2,3-Димеркаптонропан, «Дикаптол», БАЛ) - 105 мг/кг (в опыте на крысах при внутримышечном введении). 2,3 - Димеркаптоянтарная кислота («Сукцимер») - более 2 г/кг (крысы, перорально). В [91] приведено значение LD5oH изучаемого нами соединения: 2,3-Димеркаптопропансульфоната натрия («Унитиола»). Она составляет при пероральном применении 900 мг на 1 кг массы крысы. Оценка токсичности при внутривенном введении не приведена, что, по-видимому, обусловлено настолько низкой токсичностью, что её практически невозможно выявить при внутривенном введении препарата из-за большого объёма жидкости, который необходимо инъецировать экспериментальному животному.
Поскольку мы претендуем па рекомендацию перорального приема унитиола, последняя цифра показалась несколько заниженной, и мы провели серию экспериментов in vivo по определению острой токсичностью. Пероралыюе введение крысам унитиола в количестве, превышающем 2 г/кг, оказалось технически невыполнимым и нецелесообразным с фармакологической точки зрения. Кроме обнаруженной нами абсолютной нетоксичности в указанном диапазоне концентраций по критерию, рекомендованному в [62], при случайном наблюдении за животными, принимавшими участие в экспериментах (получившими 500-1000 мг/кг унитиола), обнаружено также, что последние показали существенное превышение продолжительности жизни (примерно в 1,5 раза) по сравнению с интактньши животными.
Полученные ранее в лаборатории биохимии ННЦН (1991-1997 г.г.) результаты исследований показали, что при поступлении в организм наркотических анальгетиков (как в остром, так и хроническом эксперименте) создаются условия для более активного протекания процессов ПОЛ. Возрастание скорости реакций ПОЛ совпадало с появлением признаков дисфункции печени, что констатировалось на основании достоверного повышения активности маркеров этой патологии - ферментов АЛ Г и ACT. Купирование окислительного стресса с помощью а-токоферола показало позитивные результаты: скорость ПОЛ приближалась к контрольным значениям, содержание основных компонентов неферментативной антиоксидантной защиты - также сохранялось на уровне интактных животных; активность АЛТ и ACT также приближалась к нормальным значениям.
В отличие от доказанного антиоксидантного действия а-токоферола в опыте на модельных лииидных смесях in vitro, свойства унитиола в аналогичных условиях не исшлты вались, однако имеющиеся в литературе сведения свидетельствуют об антирадикальном свойстве этого соединения. Его применяли, например, при детоксикации у обожженных больных и отметили улучшение их общего состояния и более быструю по сравнению с контрольной группой нормализацию биохимических показателей: уменьшения СОЭ, лейкоцитоза, а также нормализацию ферментных систем печени [3]. В нашем исследовании, как в остром, так и в хроническом эксперименте по интоксикации, введённый перорально унитиол показал сохранение на уровне контрольных значений скорости реакций ПОЛ и сохранение базового уровня содержания эндогенных антиоксидантов (рисунки из разделов 3.2.-3.4). По данным, позволяющим оценивать активность ферментов-маркёров патологии печени - АЛТ и ACT - при острой и хронической интоксикации морфином, можно предположить активное вмешательство в стабилизацию мембран гепатоцитов, противодействующую повреждающему действию наркотика: у животных, получавших вместо унитиола плацебо, величины активности АЛТ и ACT более чем вдвое превышают таковые в группе животных, получавших унитиол (раздел 3.2., рисунки 3.2.4. и 3.2.5.).
Объяснение мембраностабилизирующего свойства унитиола, проявившегося в указанных выше сериях экспериментов, по-видимому, не может быть дано только за счёт аналогии с классическим антиоксидантом (а-токоферолом). Мы объясняем этот эффект следующим образом.
SII-группа способна быть «ловушкой» радикала, а две SH-группы, находящиеся к тому же в вицинальном положении, активно взаимодействуют с радикалами. В этом отношении действие унитиола (и других ВД) аналогично действию а-токоферола, как прерывающего цепь окисления антиоксиданта.