Введение к работе
Актуальность проблемы. Начиная со второй половины нынешнего столетия резко возрос удельный вес вирусных болезней в инфекционной патологии человека и животных. Вирусные инфекции представляют собой сложные взаимодействия вируса и клетки—хозяина, что затрудняет поиск мишеней для химиотерапевтических препаратов. Наиболее эффективным противовирусным барьером выступает иммунная система. В связи с этим одними из наиболее опасных семейств вирусов для человека и животных являются неонкогениые ретровирусы, поражающие клетки иммунной системы. Среди них особое место занимает вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), являющийся возбудителем синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД) —опаснейшего и на сегонядшний день неизлечимого заболевания, поразившего человечество в конце XX века. Характерной чертой вирусов вообще и ВИЧ —1, в частности, является быстрое развитие устойчивости к применяемым лекарственным препаратам, что существенно затрудняет лечепие вирусных инфекций. Это справедливо и для широко применяемых в медицинской практике ингибиторов обратной траяскриптазы (ОТ) ВИЧ —1, к числу которых относится азидотимидин (ACT). Причиной устойчивости является появление характерных точечных мутаций в гене ОТ —фермента, осуществляющего репликацию вирусного генома (Larder et al„ 1989). В связи с этим особую актуальность приобретают исследования молекулярных механизмов, лежащих в основе феномена устойчивости. Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось создание эффективного продуцента ОТ ВИЧ — 1 на основе E.coli, получение мутантних форм ОТ, несущих аминокислотные замены, придающие ВИЧ устойчивость к азидотимидингу (AZT) — наиболее часто применяемому лекарственному препарату, сравнение свойств мутантных форм и ОТ дикого типа с точки зрения взаимодействия' названных ферментов с субстратами и некоторыми ингибиторами.
В ходе исследования предполагалось решить следующие экспериментальные задачи:
1. Получение штамма —продуцента ОТ ВИЧ— 1.
2. Получение мутантных форм ОТ ВИЧ—1, содержащих аминокислотные
замены, придающие вирусу устойчивость к азидотимидину (AZT)
(Asp67->Asn, Lys70->Arg, Thr215->Phe, Lys219->Gln) в различных комбинациях.
-
Разработка методов выделения препаративных количеств ОТ дикого типа и ее мутантных форм из полученных продуцентов.
-
Изучение ингибирования активности ОТ ВИЧ —1 рядом соединений класса алкалоидов.
-
Изучение влияния "AZT—устойчивых" мутаций на свойства ОТ.
Научная новизна: В настоящей работе получен штамм — продуцент,
позволяющий нарабатывать значительные количества рекомбинаитной ОТ ВИЧ —1 и разработаны процедуры выделения фермента. Получены 15 мутантов гена ОТ, несущих замены устойчивости к AZT, выделены и очищены до гомогенного состояния соответствующие мутантные формы ОТ. Изучено взаимодействие ряда алкалоидов с ферментом в комплексе с праймером — матрицей. Проведено сравнение свойств ОТ дикого типа и указанных мутантных форм. Показано изменение ряда свойств фермента в зависимости от положения аминокислотных замен и природы матрицы.
Структура и объем работы: Диссертация изложена на страницах