Введение к работе
Микротрубочки - одна из трех систем цитоскелета эукариотической клетки - играет ключевую роль в важнейших процессах функционирования и жизнедеятельности. Оки участвуют в поддержании формы клетки, ее ориентации па субстрате и способности клетки к направленному перемещение. Микротрубочки составляют структурную основу ресничек и жгутиков, обеспечивающих передвижение отдельных типов клеток. Наконец, микротрубочки формируют внутриклеточные "рельсы" для перемещения органелл и крупных частиц из одной части клетки в другую. Выполняя эти функции, микротрубочки принимают непосредственное участие в таких важнейших процессах, как транспорт материалов к вновь формирующимся участкам клеток, в частности, к нервным окончаниям, митотические движения хромосом, и определяет положение органелл в нормально функционирующей цитоплазме.
Установлено, что выполнение яикротрубочками этих функций обусловлено наличием в их составе двух типов белков - структурных MAP и белков-транслокаторов. Структурные НАР участвуют в стационарных взаимодействиях микротрубочек с другими элементами цитоскелета и мембранными органеллами. Среди них наиболее характерными представителями являются MAP 1, MAP 2, и тау. Белки-транслокаторы - это зависимые от микротрубочек механохимические АТФ-азы, способные преобразовывать энергию гидролиза АТФ в механическую энергию, обеспечивающую перемещение частиц по микротрубочкам. Основные известные до сих пор
транслокаторы - хинезин и цитоплазиатический "динеин - опосредует движение по микротрубочкам в противоположных направлениях - от центра и к центру соответственно.
Одна из существенных задач в этой области состоит в изучении взаимодействия этих двух групп белков с микротрубочками, что может пролить свет на понимание процессов функционирования этих белков в составе микротрубочек. Взаимодействие структурных MAP с микротрубочками изучено достаточно хорошо. В то же время взаимодействие с микротрубочкаыи белков-транслокаторов практически не изучено.
Цель и задачи исследования Целью данной работы является морфологическое и количественное исследование взаимодействия с микротрубочками белков из группы транслокаторов на примере кинезнка, сравнение участков связывания белков-транслокаторов и структурных ИАР на молекуле тубулина, и применение полученных данных и разработанных методов для поиска и исследования новых белков, ассоциированных с микротрубочками.
Экспериментальные задачи исследования состояли в следующем: 1) определить, какова стехиометрия связывания кинезина с микротрубочками в насыщении; 2) исследовать морфологию комплекса кинезина с микротрубочками и установить, какие участки молекулы кинезина взаимодействуют с микротрубочкамн; 3) выяснить, различаются ли участки связывания структурных MAP и белков-гранслокаторов на молекуле тубулина; 4) применить методы соосаждения белков с микротрубочками для поиска и характеристики новых MAP.
Научная новизна работы В результате данной работы впервые установлено, что связывание кинезина с микротрубочкаыи происходит с насыщением. Показано, что в насыщении кинеэин связывается с никротрубочками в соотношении 1 молекула кинезина на 7 димеров тубулина и что кинезин связывается с микротрубочками глобулярными головками, содержащими активный центр. Методом ограниченного протеолиза субтилизином получены микротрубочки, не содержащие участков тубулина, необходимых для связывания структурных MAP. С помощью таких микротрубочек впервые показано, что участки связывания белков- транслокаторов и структурных МАР на молекуле тубулина различаются. Наконец, методом соосаждения обнаружен новый белок, связывающийся с микротрубочками и предположительно являющийся одним из транспортных белков клостеровнруса желтухи сахарной свеклы. По отсутствие связывания с микротрубочками, обработанными субтилизином, этот белок причислен к группе структурных MAP.
Научно-практическая ценность работы Проведенные в данной работе исследования связывания кинезина с микротрубочками могут быть использованы для характеризации кинезиноподобных белков из различных объектов. Разработаный метод получения микрогрубочек, не содержащих С-концевых участков и выявление их способности взаимодействовать с белками-транслокаторами, но не со структурными MAP. Э*эт метод может быть использован как для выделения белков-транслокаторов из различных объектов путем одностадийной очистки от примесей структурных MAP, так и для классификации и характеристики новых белков
микротрубочек по принадлежности к одной из двух указанных групп. Второе использование метода наглядно продемонстрировано в данной работе на примере белка р65 клостеровируса желтухи сахарной свеклы, обладающего характеристиками белка из группы структурных MAP. Такие свойства впервые обнаружены у белка, кодируемого растительным вирусом и возможно установление наличия такого белка в составе растительных вирусов может пролить свет на понимание механизмов транспорта вируса из клетки в клетку.
Апробация работы Материалы диссертации докладывались на ежегодной конференции Федерации Европейских Биохимических Обществ (Дания, 1990 год) и на зимней школе "Структурные и движущие белки ядра и цитоплазмы", проводимой совместно Федерацией Европейских Биохимических Обществ и Европейской Молекулярно-Биологичекой Организацией (Австрия, 1991 год). Материалы диссертации были апробированы на заседании комиссии по переаттестации аспирантов и сотрудников Института белка РАН 23 июня 1992 года.
Публикации По теме диссертации опубликовано 3 статьи.
Структура и объем работы Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, описания результатов, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на 144 страницах машинописного текста, вклочая 15 рисунков и список литературы из 163 названий.