Введение к работе
Актуальность темы. Изучение структуры рибосомы очень важно пя понимания механизма биосинтеза белка. К настоящему времени олучены кристаллы рибосом и рибосомных субчастиц из термофильных
галофильных микроорганизмов, таких как Bacillus
tearottermophilus, Thermus thermophilus, Halobacterium
arismortui. Определение пространственной структуры такого ложного объекта как рибосома представляет собой сложную задачу, оэтому очень актуальными являются структурные исследования тдельных компонентов рибосомы, в частности рибосомных белков, а акже их комплексов с рРНК.
В Институте белка РАН ведётся работа по выделению, ристаллизации и рентгеноструктурныи исследованиям рибосомных елков из экстремально термофильной бактерии Thermus hermophilus. Белки и нуклеиновые кислоты из термофильных актерий очень стабильны и поэтому перспективны для структурных сследований. Были получены кристаллы ряда рибосомных белков (S6, 1, L30, S15, S7, L22) и определена пространственная структура елков S6 и L1 с разрешением до 2 а\ Параллельно ведётся работа о клонированию, секвенированию и суперэкспрессии генов ибосомных белков иэ этого микроорганизма.
Некоторые из рибосомных белков играют ключевую роль в сборке ибосомы и являются репрессорами трансляции. Такие белки особенно нтересны для изучения РНК-белковых взаимодействий и механизмов вгуляции трансляции. В основном это белки, связывающиеся с рРНК рочно и специфично, так называемые «серддевинные> белки. Очень нтересным объектом исследования РНК-белковых взаимодействий вляется также структурно независимый домен 50S субчастицы - 5S РНК-белковый комплекс. Настоящая работа является частью омплексных исследований РНК-связывающих рибосомных белков из .thermophilus, ведущихся в Институте белка.
Цель работы - выделение, исследование и кристализация ибосомных РНК-связывающих белков из Т. thermophilus.
Основные задачи работы: Разработка метода выделения сердцевинного:», белка-рвпрессора S8 из Т. thermophilus из клеток гамма-суперпродуцента E.coli. Изучение его РНК-связывающих войств, кристаллизация белка и первые этапы структурных сследований. Получение стабильных 5S рРНК-белковых комплексов и
их исследование.
Научная новизна и практическая ценность работы:
Разработана методика выделения белка S8 T.thermophilus из клєтої
штамма-суперпродуцента E.coli и найдены оптимальные условш
связывания белка со специфическим фрагментом 16S рРНК. Результать
работы используются при выделении других рибосомных белков и:
клеток штаммов - суперпродуцентов. Получены кристаллы белка S8,
пригодные для рентгеноструктурного анализа с разрешением не мене*
3 2. Проведены предварительные кристаллографически*
исследования. Кроме того, получены стабильные гибридные комплексі 5S рРНК из E.coli и В. stearotK^rmophilus и белков TL4 и TL5 и: T.thermophilus. Показано, что белок TL4 конкурирует за связывани* с 5S рРНК с белком L5 из рибосом E.coli, а белок TL5 - с белкамі L18 и L25 ИЗ Е. СОІІ.
Структура диссертации: Диссертация состоит из тре: частей: 1) обзор литературы, 2) экспериментальная часть, 3 результаты и их обсуждение. Работа завершается выводами и спискої цитируемой литературы ( ё/о ссылка). Работу иллюстрируют Ы-i рисунков и 2 таблицы. Общий объём диссертации '^страницы.
Апробация "работы и публикации. Результаты докладывались н; научных конференциях Института белка РАН (Пущино, 19ЭЗ, 1995) : на международной конференции <Структура и функция рибосом: (Виктория, Канада, май 1995). По теме диссертации опубликован! четыре печатные работы.
Обзор литературы посвящен исследованиям «сердцевинных РНК-связывающих белков 30S субчастицы и 5S рРНК-белковог комплекса из рибосом E.coli.' Приводятся данные об участка: связывания на РНК и белках, рассмотрены особенност пространственной структуры РНК-связывающих белков.