Введение к работе
Актуальность темы. СИ г-специфические знычнунлеазы и ДНИ- метилаяы пронариот позволяют плетне отличать собственную ДИН от чужеродной. Вся ДНК клетки после реплинации метилируется ДНК- метилазами в сторого определенных участках. Соответствующие сайт специфические энцонунлеазы отличают ее по наличию лотипированных основании в этих участках от чужеродной неметилиропянноИ ЛНК и не подвергают гидролизу. Эндонунлеазы и ДИН- метила:«і, узнающие одну и ту же последовательность образуют систему модификации-рестрикции.
Выделяют три основных класса систем модификации- рестрикции. Наибольший интерес для генетической инженерии представляют Ферменты н-го класса. Несмотря на то, что уже известно более 200 прототипов по узнаваемой последовательности, поисн их изомеров остается весьма актуальным. Неноторые изомеры обладают целым рядом свойств, делающими их более полезными для работ в генетичесной инженерии: повышенной стабильностью при хранении и/или при расщеплении ДНК, меньшей штриховой активностью, большей активностью в экстремальных условиях инкубации. Особый интерес пызывает поиск изомеров в термофильных штаммах бантерий, так как многие белки выделенные из таних бантерий обладают повышенной стабильностью.
Ферменты модификации-рестрикции являются привлекательной моделью для изучения ДНК- белкового взаимодействия, благодаря широкому разнообразию узнаваемой последовательности ДНИ, высокой специфичности и тому обстоятельству, что для многих ферментоп уже известна аминонислотная последовательность.
Интенсивный поиск саИт-специфических эндонуклеаз привел н обнаружению ферментов, не укладывающихся в первоначальную классификацию, состоящую из трех классов. При этом у ферментов модификации- рестрикции обнаруживаются свойства, позволяющие существенно расширить представление об их значении для нлетни.
Научная новизна работы. 1. В термофильном штамме Bacillus species LU11 была обнаружена новая сайт-специфическая эндонунлезза R.BspLUl II11, распознающая последовательность 5'-GGGAC-3'. Определны точки ращепления ДНК и некоторые особенности взаимодействия фермента с ДНК. Показано, что данная эндонуклеаза обладает также дополнительной ДНК-метилаэной активностью, что позволяет относить данный фермент н новому, четвертому классу систем модификации-рестрикции. 2. Обнаружена и охарактеризована отдельная сайт-специфическая
5С-метилцитозиновая ДНК-метилаза М.BspLUl1111, защищающая последовательность 5'-GGGaC-3' от расщепления R.BspLUl II 11.
-
Обнаружена и охарактеризована новая сайт-специфическая 6N" иетиладениновая ДНК-метилаза M.BspLUllII, защищающая последовательность 5'-TCTAGA-3' от расщепления R.BspLUHII.
-
Выделена и очищена сайт- специфическая эндонуклеаза из термофильного штамма Bacillus species КТ8, ноторая узнает и разрезает ДНИ по схеме: 5'-a|aGCTT-3'
3'-TTCGAlA-5' Изучены некоторые физико-хиничесние свойства фермента и свойства,
важные с точки зрения практического применения этого
териостабильного изошизомера Hindi II.
5. Из термофильного штамма Bacillus species OV выделены две
сайт-специфические эндонунлеазы BspOVl и BspOVl I. BspOVl очищена
до состояния близного н гомогенному. Она узнает
последовательность ДНК и разрезает ее кан показано стрелнами:
5 '-gacnmnJnngtc-з ' 3'-ctgnn[hnncag-5',
следовательно является изошнзомером EamllQ5l. BspOVl 1 очищена до функционально чистого состояния. Она узнает и разрезает
последовательность: 5'-АТІССАТ-3'
З'-ТАІЗСІТА-б', следовательно, является изошнзомером Clal. Изучены свойства обоих
ферментов.
Практическая ценность работы. Все выделенные ферменты получены в виде гомогенных или функционально чистых препаратов, что позволяет использовать их в работах по генетической инженерии. Изошизомеры, выделенные из термофильных штаммов, как правило более стабильны, чем эндонунлеазы- прототипы. Их также отличает ряд других прантичесни ценных свойств. Штамм Bacillus species КТ8 является природным суперпродуцентом изошизомера Hindu I. Неноторые методы, использованные в работе, применялись впервые для данного класса ферментов (определение специфичности метилирования ДНК; определение длины последовательности фланкирующей сайт узнавания и необходимой для связывания).
Апробация работы. Материалы диссертации донладывались на объединенном семинаре лабораторий Института белна РАН, на ГородсноИ научной конференции молодых ученых (Пущино, 1996), на Ежегодной научной конференции Института белна РАН (Пущино, 1996) и на семинаре Института молекулярной генетики Макса Планка (Берлин, Германия, 1996).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы.