Введение к работе
АкТуаЛЬНОСТЬ ПрОбЛеИЫ. ЭНЗИМЭТИЧеСКОЗ МЭТИЛИрОЗаЗЗ 1ГИТ03ИНОБЫ2
остатков ДНК у эукариот рассматривается как один из способоз модуляции активности генома' клетки (Ванилин 5.С, 1933; Adams,
1983; Razin, Cedar,1984). АНЭЛИЗУ УРОВНЯ И специфического Харак-
терз распределения метилированных оснований в ДНК з связи с транскрипцией, репликацией и другими генетическими процесса!/]; посвящено немало работ. В то же время сами ферменты, осусест-влящие модификацию генома, - цитозиновые ДКК-метилтрансферазы (ДНК-мт Ее 2.l.i.37),стали пристально изучаться лишь в последнее время. В отношении же ДНК-мт высших растении к начал;.- нашей работы практически ничего не Сало известно. Оставались открытыми вопросы оо их размере, множественности и структурно-функциональной организации в клетке. Отчасти это определялось специфической протеолитической фрагментацией этих ферментов in vivo и их нестабильностью при попытках выделения m vitro. Интерес к этим ферментам вызывало и то обстоятельство, что ДНК растений на два порядка сильнее метилирована, чем ДНК прокариот г на порядок больше, чем ДНК животного происхождения (ВаНЛ-ИЕ,1Э72; АНТОНОВ и ДР.,1972).
К началу настоящей работы в отделе молекулярных сенов онтогенеза было установлено, что метилирование реплицирующегося генома растений осусествляется на двух этапах: репликативном и пострепликативном (Кирнос и др., 1938). Этапы различается как скоростью, так и специфичностью метилирования ДНК. Оставалось неясным, одинаковые или разные белки Функционирует на этих двух этапах метилзгровзния ДНК. Всеми этими обстоятельства;.!;; определились цель работы и постановка экспериментальных задач. Цель работы. Выделение и изучение свойств цитезинезой ДНК-мт из ітденішк, в том числе, возможной регуляции ее активности флто-гормонами.
Экспериментальные задачи. Выделение ядерной ДНК-мт из растений пшеницы и характеристика субстратной специфичности фермента,-разработка метода выделения репликативной ДНК-мт пшеницы и изучение ее спеюности метилировать ДНК вне реплпкативного комплекса,- сравнение выделенных ферментов по молекулярной массе и субстратной специфичности,- исследование влияния фитогормоноз НЭ 1Л vitro метилирование гомологичной ДНК очищенным препаратом ДНК-мт и ядерным экстрактом из пшеницы.
Научная новизна и практическая значимость. Зпервые выделена высокомолекулярная форма ДНК-мг из растений пеэеицы. Предложен
оригинальный метод выделения репликативной формы ДНК-мт с помопью аффинного связывания с формирующейся s-azac-содаржаЕей ДНК при репликации генома. Впервые показано, что репликативная ДНК-мт способна метилировать ДНК вне репликативного комплекса, при этом по молекулярной массе, активности и субстратной специфичности она практически не отличается от ДНК-мт, выделенной из ядерной фракции. В ядре растительной клетки впервые выявлена модулируемая фатогормонами, система контроля за метилированием ДНК. Полученные результаты ва?лы для понимания структурно-функциональной организации процесса метилирования ДНК в растительной клетке. Работа имеет теоретический характер. Мояет Сыть использована в курсах лекция по молекулярной биологии, биохимии и физиологии растений на Биологических факультетах университетов. Разработанные подходы и результаты уже используются в НИР в Институте Физико-Химической биологии им. А.Н.Белозерского МГУ.
Апробация работы. Результаты работы докладывались на семинарах в лаборатории молекулярных основ онтогенеза НИИ Физико-химической биологии им. Белозерского, на ш съезде Всероссийского общества физиологов растений (Санкт-Петербург, 1993), на Third New England
Biclabs Workshop on Biological DNA Modification (Vilnius, 1994).
Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 12S страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение, выводы и список цитируемой литературы. Работа проиллюстрирована 8 рисунками и 7 таблицами. Список цитируемой литературы содержит і S наименования.