Введение к работе
Актуальность проблеми. Взаимосвязь структуры мРНК и эффективности пшішши трансляции, определяющей уровень экспрессии генов, давно привлекала шманпс исследователей. Были исслелояанм многочисленные последовательности [ЧІК. особенно в области инициации трансляции генов, имеющих высокий уровень гспрсссин. Определен ряд первичных детерминант. Сформулировано общее іедстаплснис о механизме инициации трансляции. Созданы и удачно функционируют ногочпеленные системы для экспрессии гстсрологичных генов п Е. colt. Но часто .тает не вполне понятен молекулярный механизм этих взаимодействий. Остается ^решенной проблема выбора - какой именно участок на 16S РНК непосредственно іанмодеГіствуст с активным элементом в структуре мРНК. Комплементарные занмояействня этих элементов с соответствующими участками на 16S РНК, прелеленные путем простого сравнения, часто не могут быть реализованы из-за герпческих факторов. Кроме этого остается много вопросов, связанных с дальними занмоленствиями. когда на рибосом-связываюший сайт оказывают влияние области, алско расположенные от инициирующего колона.
13 последние годы очень продвинулось направление компьютерного юдегшрованпя рибосом, когда на основе обширного экспериментального материала оздаются пространственные модели 30S и 70S субчастиц. Это позволяет с большей [остоперностыо решать задачу обнаружения новых рибосом-связьіваюішіх сайтов на іРНК и кроме этого оптимизировать положения уже известных трансляционных силитслей в 5'-нетранслируемойобласти мРНК.
По пому актуальными являются работы, направленные на выяснение дехашнмов функционирования этих элементов, оказывающих решающее влияние на іффскіивностьинишіашіи трансляции и на уровень экспрессии генов.
Цель работы заключалась в нахождении зависимости уровня экспрессии эяда генов в Е. coli от структуры участка тгициашш трансляции (TIR), а также изучеіше ілияіпія далыпгх взаимодействий на рибосом-связывающий сайт. В качестве модельных ~енов использовался ген человеческого шггерлейкина-3, а также ряда гибридных белков
та его основе.
Кфкретные задачи состояли в следующем
- изучение зависимости уровня экспрессии гена от первичной сі руктуры
TIR;
изучение влияния на уровень экспрессии гена дальних взаимодействии в мРНК, приводящих к образованию участков віоріїчной структуры с участием ТІ R;
создание новых нлазмидных векторов с оптимальной сі руктурон TIR для достижения высокого уровня экспрессии генов'
Научна» ношгша и нрак-іичеі-кам ипшшн, рабои.і. К раГнис леїалі.но проаналшнровш іьі влияние на экспрессию генов в Ь.г«//структуры 5 '-неіранслируаі оіі области мРНК и значение в этом процессе комплементарных взаимодействий мРІ 1К с 16S рРНК. Показано, что на комплементарные взаимодействии участка инициации трансляции с 16S рРНК и, следовательно, на его эффективность оказывает влияние вторичная структура мРНК, включающая днетальныеобласти мРПК.
Это обеспечило создание серии новых векторов для эффективной прокарнотической экспрессии гетерологнчных генов, которая имеет очень важное практическое значение. При клонировании в этих новых век-юрах достигнут высокий уровень биосинтеза нескольких рекомбииантных белков.
Апробации работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены па: 1-ой германо-российской летней школе по системам ш vino, Берлин, 1994 г.; Юбилейной научной сессии МИТХТ, посвященной 100-легшо со дня рождения проф. НА. Преображенского, Москва, 1996 г.;11-ом съезде биихнмнческотообщества РАН, Москва, 1997 г.
Публикации. 11о материалам диссертации опубликовано 8 рабог.
Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, обзора литературы, обсуждешія результатов, экспериментальной части, списка цнтированной литерагуры (186 ссылок).