Введение к работе
Актуальность проблемы. Исследования фундаментальных проблем ыолекулярной биологии и генетики, а также прикладных аспектов генной инженерии, клинической медианы и эпидемиологии выдвигают новые задачи в изучении структуры и функции плазмид.
Плазмидоноеительство - существенный фактор изменчивости и эволюции бактерий, так как генетическая информация плазмид может расширить адаптивные возможности бактерий, что приобрело особо важное значение для их выживаемости в условиях повышенной агрессивности окружающей среды вследствие загрязнения ее химическими реагентами, а также целенаправленного создания и массового применения антибактериальных агентов.
Ялазмидные гены могут принимать участие в формировании
разнообразных признаков клетки-хозяина, вносить вклад в спон -
тайную и индуцируемую мутабильность ( Hortelmans et al., 1976;
Brower et al., 1981), репликацию и рекомбинацию хромосомной
ДНК бактериальных клеток, их устойчивость к действию различных
повреждающих агентов ( Boulnois et al., 1979; Tamagushi et al.,
1980; *ott|r et al.,I983; Willetts et al., 1984; Чернин Л.С,
1985). і
Изучение плаэмидиых детерминантов устойчивости к антибактериальным-дгентаы имеет важное значение для понимания механизмов взаимодействия плазмидного и хромосомного геномов. Исследования ,в области генетики и циркуляции плазмид резистентности, их роли в патологических процессах в совокупности с исследованиями молекулярных механизмов действия антибиотиков и механизмов антибиотнкореэистентности способствуют целенаправленному поиску хшшотерапевтических средств.
Сложность функциональных связей плазмидного и хромосомного геномов обусловлена как гетерогенностью плазмид в плане генетической организации, так и видовым многообразием клеток-хозяев, осуществляющих генетический контроль и создающих специфический фон для активности плазмид ( Чернин Л.С, 1978).
Участие плазмид в генетических процессах бактериальных клеток может быть как конститутивным, так и индуцируемым. Эффекты плазмид могут носить и регуляторний характер, взаимодей-чтвуя с регуляторной функцией хромосомных генов.
Исследование Н-фактора pGKIOI клеток Salmonella derby представляет интерес в связи с множественностью эффектов плаз-
_ 4 -миды, которая, наряду с формированием лекарственной устойчивости бактерий ( Саркисян Н.Н. и др., 1986), оказывает влияние на их формообразование и ультраструктуру мембран ( Кцоян Ж.А., 1991), метаболизм мембранных фосфолипидов ( Pepoyan et al., 1990), УФ-чувствительность и фагочувствительность ( Антонин Р.Г., Кцоян Ж.А., 1988).
Многие структурно-функциональные свойства клеток s. derby, ассоциированные с R-фактором, обусловлены организацией их клеточных оболочек, что предопределило интерес к исследованию влияния плазмиды на структурные компоненты мембран и их функцио -нальную активность.
Изучение механизмов эффектов крупных плазмид представляет собой сложную задачу как в связи с неоднозначностью состояния плазмидных молекул в клетке ( возможность диссоциации на более мелкие плазмиды), так и в связи со спецификой клеток-хозяев . Возможным подходом к изучению проблемы плазмидно-хромосомных взаимодействий в этих случаях является исследование: эффектов плазмид в штаммах дикого типа; мутантов, природа дефектов которых более или менее идентифицирована генетически и биохимически; трансформантов, полученных передачей плазмидной ДНК при трансформации.
Цель и задачи исследования. С целью исследования влияния R-фактора pGKIOI на белковый спектр и функциональную организацию мембран клеток S. derby , для выявления механизмов взаимодействия плазмидного и хромосомного геномов в системе pGKTOI- s. derby , необходимо было решить следующие задачи:
-
Исследование качественного и количественного составов белков мембран и цитоплазм штамма S- derby дикого типа и его плазмидных и бесплазмидных производных.
-
Выявление белковых компонентов мембран клеток s. derby,
.обусловленныхR -плазмидой, их роли в функциональной организации мембранных структур бактерий.
-
Исследование механизмов устойчивости s. derby к антибиотикам.
-
Исследование трансформантных штаммов S. derby для выявления влияния плазмидной ДНК на качественный и количественный составы мембранных белков и фосфолипидов.
Научная новизна. Впервые исследованы белковые спектры мем-
- 5 -бран и цитоплазм плазмидных и бесплазмидных клеток S. derby, что позволило выявить существенное влияние R-фактора pGKIOI на качественный и количественный составы белков этих клеток.
Результаты, полученные при исследовании трансформантных -штаммов, подтвердили детерминирующую рольй-шгазмиды в организации белков и фосфолиггидов мембран плазмидных штаммов S. derby, что было доказано воспроизведением структурных и функциональных характеристик плазмидного штамма после введения в бесплаэ-мидные клеткий-фактора pGKIOI в полном объеме.
Полученные данные о преобладающих белковых компонентах мембран піазмияного и бесплязмидного штаммов S. derby позволяют анализировать барьерные функции внешней и внутренней мембран этих клеток по отношению к антибиотикам и детергентам.
Полученные данные о влиянии R-фактора pGKIOI на поверхностные структуры s. derby позволяют высказать предположение о влиянии плазмиды лекарственной устойчивости на вирулентность клеток s. derby, что представляет интерес для дальнейших исследований.
Практическая ценность. Результаты работы способствуют по-ниматга молекулярных основ формирования мембранных структур и их функциональных свойств, которые являются результатом взаимодействия плазиидяого и хромосомного геноиов в системе и-фактор pGKIOI- s. derby.
Исследование, ыембран s. derby и их модификаций, обусловленных н-фактором,имеет важное значение для клинической медицины в связи с ключевой ролью поверхностных структур в виру -лентности, лиганд-рецепторных взаимодействиях, адгезии и развитии заболевания в целом, а также фагочувствительности сальмонелл.
Полученные данные представляют практический интерес для решения проблем антибиотикотерапии, так как способствуют целенаправленному поиску и применению антибиотиков.
Апробация работы. Результаты работы доложены на семинарах группы репарационных систем клетки и ученых советах Института экспериментальной биологии АН АрмССР.
Работа апробирована на заседании ученого совета Института молекулярной биологии НАН РА от 21 декабря 1996 года.
Публикации. Основные результаты исследования, представленные в диссертационной работе, изложены в четырех статьях и тезисе.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, ре -зультатов собственных исследований и их обсуждения ( 3 главы ), заключения, выводов и списка литературы.
Работа изложена на 100 страницах машинописного текста, содержит 8 рисунков и 5 таблиц.