Введение к работе
Актуальность проблемы. Регуляция биосинтеза белка является одной из центральных проблем молекулярной биологии. Изучение свойств и функций белков мРНП - универсальной формы существования мРНК в клетках эукариот, является важной частью этой проблемы.
Вся мРНК эукариотической клетки существует в форме мРНЛ частиц СннформосоиЭ. Различают транслируемые мРНП полирибосом и свободные СнетранслируемыеЭ мРНП. Фракция свободных мРНП клетки обычно функционально гетерогенна и может включать в себя мРНП, находящиеся в равновесии с мРНП полирибосом, мРНП на стадии перехода из ядра в цитоплазму, а также мРНП, содержащие репрессированные и маскированные мРНК.
Предполагается, что функциональное состояние мРНК в клетке зависит от белков, ассоциированных с ней.. Согласно этой концепции, набор белков в разных классах мРНП должен различаться. В препаратах суммарных мРНП, содержащих набор разных мРНК, обнаруживают белки, представленные в качестве минорных и мажорных компонентов. Миноры могут быть специфичны для определенных мРНК или классов мРНК и отвечать за регуляцию синтеза определенных белков, тогда как нажорные белки ассоциированы со всеми или почти всеми мРНК и могут осушествлять глобальный контроль белкового синтеза в клетке.
мРНП, выделенные из различных клеток и тканей, содержат два нажорных белка" с молекулярными массами 70 и 50 кДа. Белок 70 кДа является полис A3-связывающим белком СРАВРЭ, ассоциированным с 3' концевой полисA3-последовательностью мРНК. Этот белок высоко консервативен в эволюции и присутствует в большинстве, если не во всех, эукариотах. Белок 50 кДа Ср503 является преобладающим белком свободных мРНП соматических клеток. Он присутствует также в полирибосомных мРНП, но в меньших количествах. Функциональная роль этих двух белков в трансляции мРНК в настоящее время мало изучена.
Цель и ' задача исследования. Настоящая работа посвящена изучению роли белков свободных и полирибосомных мРНП ретикулоцитов кролика в трансляции. В1 связи с этим были поставлены следующие задачи: а/ выделение препаратов свободных и полирибосомных мРНП; б/ исследование особенностей трансляции
полирибосонных и свободных нРНП и нРНК, входящей в состав соответствующих частиц, в бесклеточных системах трансляции Из ретикулоцитов кролика и зародышей пшеницы; в/ исследование влияния мажорных белков нРНП, р50 и РАВР, на трансляцию мРНК в бесклеточных системах.
Научная новизна работы. В результате проведенных исследований показано. что белки, ассоциированные с мРНК ретикулоцитов кролика, способствуют более эффективной трансляции мРНК in vitro. В частности показано, что в системе из ретикулоцитов кролика белки мРНП предотвращают ингибирование ' трансляции, вызываемое высокими концентрациями матрицы, и делают бесклеточную систему активной в пдірокои диапазоне концентраций мРНК. При исследовании трансляции нРНП и мРНК. выделенной из них, в бесклеточной системе трансляции из зародышей пшеницы оказалось, что свободные мРНП ретикулоцитов кролика, в отличие от полирибосонных мРНП или нРНК, транслируются с очень низкой эффективностью, что вызвано блоком инициации трансляции свободных «РНП. Добавление фракции белков, смытых с рибосом ретикулоцитов кролика 0,5 М КС1, в пшеничную систему приводит к активации трансляции свободных нРНП. На основании полученных результатов было сделано предположение о существовании в ретикулоцитах кролика специальной системы «репрессии/активации», регулирующей распределение мРНК между фракциями свободных мРНП и полирибосом. Данная систена, по-видимому, включает в себя:
- репрессор трансляции, ассоциированный с мРНК в составе
свободных нРНП;
- активатор трансляции, ассоциированный с рибосомами и снимающий
действие репрессора.
Исследовано влияние двух мажорных белков мРНП: р50 и РАВР, на трансляцию мРНК in vitro- Показано, что р50 полностью ингибирует трансляцию мРНК в бесклеточной систене. РАВР, напротив, значительно стимулирует трансляцию.
Методом непрямой иимунофлуоресцентной никроскопии выявлены различия во внутриклеточной локализации белков: антитела против р50 окрашивают преимущественно цитоплазну клеток, тогда как антитела против РАВР окрашивают как цитоплазму, так и ядрышки. Сосредоточение РАВР в ядрышках, месте, где происходит синтез пре-рРНК, согласуется с полученными данными о высокой аффинности РАВР к рРНК. На основании этих результатов сделано
предположение о существовании новой функции РАВР, связанной с процессами, происходящими в ядрышках.
Апробация работы. Основные результаты работы были доложены на конференции «Трансляционный контроль» CCold Spring Harbor, США, 1989Э, 4-ом Европейском конгрессе по клеточной биологии СПрага, 19943 и ежегодной научной конференции Института белка РАН СПущино, 1994Э.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ.
Структура диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов: «Введение», «Обзор литературы», посвященный описанию свойств и функций белков цитоплазкатических нРНП, «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Выводы» и «Список цитированной литературы» С 225 ссылок!).