Введение к работе
Актуальность проблемы
Совершенствование методологии рекомбинантных ДНК поразительно засширило возможности направленного биосинтеза белка. Среди различных :истем экспрессии генетических детерминант, в том числе экспрессии етерологической, значительное место занимают прокариотические системы, эактериальные суперпродуценты позволяют получать значительные количества зысокоочищенных рекомбинантных белков для использования в медико-эиологических и сельскохозяйственных целях.
Поскольку нативный эукариотический ген из-за мозаичности своей структуры не может быть непосредственно использован в такой системе, один 43 наиболее распространенных генноинженерных подходов к синтезу эукариотических белков состоит в конструировании безынтронного гена делевого белка и введении его в бактериальный вектор, содержащий
эегуляторные элементы, необходимые для экспрессии гена. -8- ашй.
юследовательнасім-еебьт^й в - наименьшей -степвТОГТЗбёсгТечен рацйонагть-ной зоновой- Заключительный этап синтеза белка - трансляция, особенно ее инициация. Хотя о молекулярной природе детерминантов трансляции у прокариот известно многое, именно исход трансляции наименее предсказуем, гак что создание новых эффективных генноинженерных конструкций не только позволяет получать нужный белок, но и вносит вклад в изучение механизма трансляции у прокариот.
Цель работы
Целью работы было создание эффективных векторов для экспрессии синтетических генов в E.coli и получение на их основе штаммое продуцентов зрелого интерлейкина-1а человека и его рецепторного антагониста.
Научная новизна и практическая ценность работы
Развитие методов генной инженерии сделало возможным синтез природных и модифицированных белков и пептидов в разнообразных прокариотических и эукариотических системах. Вместе с тем даорой* на пути исследований подобного рода возникают проблемы, решение которых требует новых генноинженерных конструкций. Нередко эти проблемы связаны с
эффективностью трансляции, прежде всего, ее инициации. В ходе синтеза и изучения экспрессии генов некоторых цитокинов человека мы сконструировали экспрессирующие векторы, различающиеся областью связывания рибосом (рис.1); в их основе лежит плазмида pGEM1, которая по существу предназначена для транскрипции in vitro, но, будучи снабженной участком связывания рибосом, способна также функционировать в системе белкового синтеза. Полученные векторы были использованы нами, в частности, для экспрессии гена зрелого интерлейкина-1а человека, которой не удавалось добиться в ряде стандартных векторов. Новый экспрессирующий вектор pGEN, содержащий в области связывания рибосом энхансер трансляции из гена 10 фага Т7, позволил получить интерлейкин-1а с выходом около 10% от суммарного клеточного белка. Еще более высокого уровня экспрессии - более 30% - удалось достичь в случае вектора pGMCE, в котором целевой ген составляет вторую часть двуцистронной конструкции, а энхансер трансляции и последовательность Шайна-Дальгарно для целевого гена введены в кодирующую часть первого, короткого искусственного гена (миницистрона). В этом же векторе был клонирован ген рецепторного антагониста интерлейкина-1, доля которого в суммарном клеточном белке составила 13%. Эффективность сконструированных участков инициации трансляции проанализирована не только in vivo, но и in vitro.
Структура работы
Диссертация, изложенная на ///страницах, включая Зб рисунков, содержит три главы - обзор литературы, посвященный оптимизации трансляции в прокариотических системах экспрессии генов, обсуждение полученных результатов, описание материалов и методов, использованных в работе, а также список цитируемой литературы (U-Po ссылок).
Презентация материала
Материал, представленный в диссертации, опубликован в трех статьях, а также доложен на VI конференции Российской Федерации "Новые направления биотехнологии" (Лущино, 1994) и на XI Международном круглом столе "Нуклеозиды, нуклеотиды и их биологическое применение" (Левен, 1994).