Введение к работе
Актуальность проблемы. Нитевидный бактериофаг М13 сыграл существенную роль в становлении и развитии методологии рекомбинантных ДНК. Широкое использование бактериофага М13 в экспериментальной практике молекулярно-биологических исследований (сиквенс ДНК, получение радиоактивных проб ДНК для гибридизации, сайт-направленный мутагенез) связано прежде всего с особенностями его жизненного цикла. Этот бактериофаг входит вместе с fl и fd в группу близкородственных фагов под общим названием Ff. Он специфичен к клеткам Е. coli, несущим F фактор и имеющим половые ворсинки. Геном бактериофага представляет собой одноцепочечную ковалентно замкнутую кольцевую ДНК. В процессе воспроизводства геномная ДНК проходит стадию двухцепочечной реп-ликативной формы (РФ). Отличительной чертой морфогенеза нитевидных бактериофагов является то, что вирион собирается не внутри бактерии, а на мембране. По мере выхода из клетки одноцепочечная ДНК покрывается белками оболочки, и вновь собранные частицы секретируются во внеклеточное пространство. Зараженная клетка не лизируется фагом, продолжает расти, хотя и с несколько меньшей скоростью. Фаг не теряет жизнеспособность при широком варьировании размеров генома, что позволяет использовать его в качестве клонирущего вектора.
Несмотря на уникальные особенности нитевидных бактериофагов они не нашли должного применения в решении задач одного из важных направлений современной генной инженерии и биотехнологии - достижения эффективной экспрессии чужеродных генов в клетках бактерий. Проведение такого рода исследований дает не только новые возможности экспериментаторам, но и расширяет наши представления об используемом объекте.
В последнее время интерес к нитевидным бактериофагам существенно возрос в связи с новым активно развивающимся направлением генной инженерии, получившим название "пептидный дисплей на капсидах нитевидных бактериофагов" или просто "фаговый дисплей". Суть фагового дисплея заключается в экспонировании пептидов и белков на поверхности инфекционной частицы нитевидного бактериофага путем экспрессии чужеродного генетического материала в виде слитого с одним из его покровных белков единого полипептида. Физическая сцепленность анализируемого полипептида и кодирующего его генетического материала в составе одной
2 фаговой частицы обеспечивает возможность очень простого отбора и ан; лиза вариантов белковых молекул, эспонированных на поверхности ві риона. Данная техника открывает новые возможности в исследовании тої ких механизмов молекулярных взаимодействий и представляется весьм перспективной для создания вакцин и диагностических тест-систем.
До начала настоящей работы была известна лишь одна векторная с№ тема экспонирования чужеродных пептидов на поверхности нитевидны бактериофагов, основанная на использовании минорного белка (А-белк; оболочки, представленного в вирионе только пятью копиями. Более прі влекательным для решения некоторых задач фагового дисплея может быт основной белок (В-белок) оболочки, представленный в вирионе тремя ть сячами копий. Однако до нашей работы в литературе не было описано пс лучения нитевидных бактериофагов даже с минимальными изменениямі такими, например, как единичные делеции или вставки аминокислотны остатков в В-белке без существенной или полной потери их инфекционнс сти.
Цель и задачи исследования. Основная цель настоящей работы заклк чалась в создании систем экспрессии клонированных в Е. сой генов с ис пользованием фага МІЗ, и исследовании их характеристик на примере ря да генов, разработке способов получения жизнеспособных вариантов фаг М13 экспонирующих на своей поверхности чужеродные пептиды в состав основного белка оболочки.
Для выполнения поставленной цели необходимо было решить еле дующие основные задачи:
-клонировать в составе бактериофага М13 ген а2-интерферона чело века и ген РНК-полимеразы бактериофага Т7;
-изучить факторы, влияющие на экспрессию чужеродных генов, кло нированных в составе бактериофага М13;
-разработать векторную систему экспрессии чужеродной генетическоі информации, зависимой от РНК-полимеразы бактериофага Т7, с раздель ным введением в клетку целевого гена и гена РНК-полимеразы. Исследо вать факторы, влияющие на экспрессию генов различного происхождениі при использовании данной системы;
-на основе бактериофага М13 получить векторы для экспонированш на поверхности вириона чужеродных пептидов;
-исследовать возможность направленной реконструкции основного белка оболочки нитевидного бактериофага М13 для задач фагового дисплея и создания на его основе иммуногенно-активных частиц.
Научная новизна и практическая значимость работы. На примере синтетического ген-эквивалента а2-интерферона человека (HuIFa2) и гена РНК-полимеразы бактериофага Т7 исследованы возможности бактериофага М13 в качестве вектора экспрессии чужеродной генетической информации в клетках Е. coli. Продемонстрировано, что бактериофаг М13, несущий чужеродные гены, способен обеспечить высокую продукцию соответствующих полипептидов в инфицированных бактериях. Проведено сравнительное изучение экспрессии в клетках Е. coli гена а2-интерферона, находящегося в составе плазмидного вектора серии pBR или бактериофага М13. Впервые установлено, что более высокий уровень синтеза интерферона обеспечивает фаговый вектор. Получен высокоэффективный продуцент РНК-полимеразы бактериофага Т7, на основе которого в НПО "Вектор" налажено производство этого фермента.
Впервые предложен и экспериментально обоснован новый подход к экспрессии клонированных в Е. сой генов. Сконструирована и подробно исследована система для экспрессии генов, основанная на раздельном введении в клетки бактерий целевого гена, находящегося в составе плазмидного вектора под контролем позднего промотора ТФ10 бактериофага Т7, и гена соответствующей РНК-полимеразы, клонированной в составе бактериофага М13. В рамках исследования осуществлено молекулярное клонирование кДНК а I-антитрипсина человека, установлены различия в клонированной последовательности от опубликованной ранее. Получены бактериальные штаммы-продуценты: 1) важного для медицины белка - ссі-анти-грипсина человека; 2) иммуногенно-значимых фрагментов белка Е2 вируса зенесуэльского энцефаломиелита лошадей, представляющих интерес для іиагностики и создания молекулярной вакцины против указанного забо-тевания.
Впервые экспериментально доказана возможность использования основного белка оболочки нитевидных бактериофа гов для задач фагового іисплея. Получены жизнеспособные производные фага М13 со встройкой в эсновной белок оболочки чужеродных пептидов. Продемонстрирована зозможность создания искусственных иммуногенов при встройке антиген-гых детерминант в В-белок фага М13. Полученные результаты указывают
4 на возможность направленного изменения антигенных и иммуногенны свойств В-белка нитчатого фага М13 и его использование в качестве ноа теля пептидных антигенных детерминант.
Полученные в данной работе рекомбинантные плазмиды, штаммы фг гов, бактерий и синтезируемые ими продукты переданы в ряд научных ор ганизаций, где они нашли применение для научно-исследовательских прикладных целей: Институт биоорганической химии им. Шемякина РАБ Новосибирский институт биоорганической химии СО РАН; Институт ци тологии и генетики СО РАН; Институт молекулярной биологии и генетикі АН Украины; Университет им. Каминского, Братислава, Словацкая рее публика; 2-ой Римский университет, Италия; Бостонский университет США; Институт молекулярной биофизики при университете штата Фло рида, США и др.
Апробация работы. Представленные в диссертации результаты бьілі доложены на различных конференциях и симпозиумах,в том числе: Всесо юзных конференциях "Новые направления биотехнологии" (Пущино, 1984 1988, 1990, 1992), Всесоюзной конференции "Гибридные плазмиды и экс прессия плазмидных генов" (Москва, 1984), Всесоюзном съезде микробио логического общества "Достижения микробиологии — практике" (Алма Ата, 1985), Всесоюзной конференции "Итоги и перспективы теоретических практических и клинических исследований по проблеме интерферона' (Тбилиси, 1985), Всесоюзном симпозиуме "Проблемы переноса генетиче ской информации" (Москва, 1985), Всесоюзных конференциях "Геном че ловека" (Москва, 1990, 1991), Международном симпозиуме "Symposium or . bioanalitical methods" (Прага, 1991), Международной конференцій "Medical biotechnology immunization and AIDS" (Ленинград, 1991), Международной конференции "Phage display" (Cold Spring Harbor Laboratory Long Island, New York, 1992), Международном семинаре "VIII International Conference on AIDS/III STD World Congress" (Амстердам, 1992), Всероссийской отчетной конференции по направлению "Белковая инженерия' (Москва, 1993), VI конференции Российской Федерации "Новые направления биотехнологии" (Пущино, 1994), IV Научно - практической конференции врачей "Актуальные вопросы современной медицины" (Новосибирск, 1994), Международной конференции "Molecular biology at the border of XXI century. Genome structure and functional analysis" (Москва, 1994), а также на научных конференциях НПО "Вектор" и семинарах факультета естествен-
5 ных наук Новосибирского государственного университета, кафедры природоведения Университета Братиславы, кафедры физики Бостонского университета, кафедры биологии 2-го Римского университета, Института молекулярной биофизики при университете Талахаши Флорида, США, на презентации ГНЦ Вирусологии и Биотехнологии "Вектор" в Польше (Варшава - Гданьск, 1994).
Работа выполнена в 1984-1993 годах в НПО "Вектор" в рамках научных тем НПО "Вектор" и по грантам государственных научно-технических программ "Геном человека", "Новейшие методы биоинженерии", "Новейшие методы биотехнологии". На разных этапах ее выполнения в ней приняли участие О.О. Миненкова, Н.В. Тикунова, Г.А. Кузмичева, у которых автор являлся научным руководителем диссертационных работ, а также С.Н. Щелкунов, СИ. Татьков, С.Я. Головин, В.Н. Красных, Н.В. Меламед, Н.Н. Микрюков, Н.Н. Карпышев, A.M. Ерошкин, Г.П. Кищенко и другие сотрудники НПО "Вектор", которым автор приносит искреннюю благодарность.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 43 работы.