Введение к работе
Актуальность проблемы. Известно, что двухиепочечные молекулы ДНК в составе биологических объектов (вирусы, хромосомы) находятся в компактном, плотноупакованном состоянии, для которого характерна, прежде всего, высокая (достигающая SO %) локальная концентрация ДНК и высокая степень пространственной упорядоченности. Еще одной важной особенностью пространственной укладки молекул (или сегментов! ДНК в составе биологических объектов является ее высокая лабильность, выражающаяся в способности быстро и обратимо менять степень компактности и характер упорядочения молекул (или сегментов) ДНК в зависимости от функционального состояния клетки.
Исследование конкретных особенностей упаковки молекул ДНК в биологических объектах было, и остается до настоящего времени, проблемой, не имеющей однозначного решения. Это обусловлено как сложностью структуры биологических объектов, так и недостаточным совершенством методов исследования. Возможное решение этой актуальной проблемы молекулярной биологии заключается в создании модельных систем, отражающих основные черты пространственной упаковки молекул ДНК в составе биологических объектов. Одной из таких модельных систем, привлекающих в последние годы внимание не только молекулярных биологов, но и специалистов других областей науки, являются жидкие кристаллы, образующиеся как при концентрировании растворов ДНК, так и при фазовом исключении молекул ДНК. Выбор жидкокристаллических Фаз ДНК в качестве модельной системы обусловлен тем, что, несмотря на высокую концентрацию ДНК в таких фазах, для молекул ДНК в их составе характерна не только высокая степень структурной упорядоченности, но и молекулярная подвижность, т.е. свойства, присущие реальным структурам ДНК in vivo.
Наличие информации об условиях образования, типах и свойствах жидкокристаллических фаз ДНК позволило приступить к следующему этапу изучения этой молельной системы, а именно, к исследованию жидкокристаллических дисперсий ДНК. Целесообразность такого перехода продиктована тем, что биологические объекты такие, как вирусы и хромосомы, представляют собой, по существу, дисперсные системы, для которых, помимо перечисленных выше особенностей, ха-
рактерен еще и микроскопический размер. Исследование жидкокристаллических дисперсий ДНК представляется более перспективным как с молекулярно-биологическои, так и физико-химических точек зрения. Эта модель важна потому, что она позволяет выявить влияние ряда факторов (например, ионного состава среды, наличия в ней полимеров биологического происхождения и биологически активных соединений и т.д. ), в значительной степени определявших организацию и устойчивость живых систем. Следовательно, настоящая работа, находясь на стыке молекулярной биологии и физической химии биополимеров, позволяет сделать еще один шаг к более глубокому пониманию механизмов и роли факторов, определяющих и регулирующих характер упаковки двухцепочечных молекул іили сегментов) ДНК в составе биологических объектов.
Цель работы- Цель настоящей работы состояла в детальном изучении условий образования и свойств жидкокристаллических дисперсий, формируемых в результате фазового исключения линейных двухцепочечных молекул ДНК из Еодно-солевых растворов, содержащих нейтральный полимер - полиэтиленгликоль (ПЭГ), и в результате конденсации ДНК в водно-солевах растворах под действием поликатионов, а также в исследовании возможности управления характером упаковки молекул нуклеиновых кислот в частицах дисперсий.
Основные задачи исследования. В задачи исследования входило:
-
определить условия образования дисперсий линейных двухцепочечных молекул ДНК в растворителях, различающихся по структуре и свойствам, и исследовать свойства этих дисперсий;
-
установить тип (типы) упаковки молекул ДНК в частицах дисперсий;
-
проанализировать роль факторов, способных влиять на оптические свойства жидкокристаллических дисперсий ДНК;
-
исследовать возможность управления пространственной упаковкой молекул ДНК в частицах жидкокристаллических дисперсий:
в результате модификации структуры молекул ДНК;
в результате изменения катионного состава, температуры и свойств растворителя;
при помощи биологически активных соединений.
5. оценить вероятность использования жидкокристаллических
дисперсий ДНК в качестве основы для создания аналитических систем
(биосенсоров), предназначенных для определения биологически активных соединений, "мишенью" которых является генетический материал клетки.
Научная новизна работы. При выполнении настоящей работы получен ряд новых, приоритетных результатов.
Впервые показано, что при определенных условиях пространственная упаковка молекул ДНК в частицах дисперсий, образующихся при фазовом исключении, аналогична упаковке молекул ДНК в холес-терических жидких кристаллах, т.е. доказано существование холес-терических жидкокристаллических дисперсий двухцепочечной ДНК.
Впервые установлено, что изменение структурных параметров двухцепочечных молекул ДНК при действии химических агентов или физических факторов приводит к тому, что из модифицированных молекул ДНК формируются жидкокристаллические дисперсии, обладающие организацией пространственной структуры, отличающейся от холесте-рической. Формирование жидкокристаллических дисперсии ДНК разного типа отмечено также при изменении диэлектрической постоянной, катионного состава и температуры водно-солевого раствора ПЭГ.
На примере жидкокристаллических дисперсий, сформированных из комплексов (ДНК-поликатион), впервые продемонстрировано, что характером пространственной упаковки молекул ДНК можно управлять при помощи низких концентраций биологически активных соединений.
Впервые показано, что холестерические жидкокристаллические дисперсии ДНК и жидкокристаллические дисперсии комплексов (ДНК-поликатион) можно использовать в практических целях для создания аналитических систем (биосенсоров), предназначенных для определения разных классов биологически активных соединений, различающихся как по своей химической природе, так и по механизму взаимодействия с генетическим материалом клетки.
Практическая ценность работы. Обнаруженная s настоящей работе зависимость степени компактности и характера пространственной упаковки молекул ДНК от катионного состава растворителя имеет важное значение для понимания механизмов регуляции функциональной активности хромосом в условиях изменения ионного состава внутриклеточной среды.
Установленные в работе факторы управления пространственной организации жидкокристаллических дисперсий ДНК следует учитывать
при описании свойств жидкокристаллических структур, образуемых молекулами других биополимеров, в частности, белками и полисахаридами ,
Жидкокристаллические дисперсии ДНК можно рассматривать в качестве простой и удобной модельной системы, позволяющей исследовать роль факторов и природу движущих сил, определяющих особенности организации третичной структуры двухцепочечных молекул ДНК in vivo. Это обстоятельство необходимо учитывать при формировании представления о жидкокристаллической упаковке молекул (или сег-ыентов) ДНК не только в головках бактериофагов и хромосомах простейших, но и в хромосомах эукариот.
"Отклик" пространственной структуры жидкокристаллических дисперсий ДНК и жидкокристаллических дисперсий комплексов (ДНК-поликатион) в ответ на действие химических агентов и физических факторов использован при конструировании биодатчиков (Патент РФ N 2032695, Патент РФ N 2107260, Патент РФ N 2123008), позволяющих детектировать наличие в среде биологически активных соединений, "мишенью" которых является генетический материал клетки. Тем самым, сделаны первые практические ваги в новом направлении аналитической биотехнологии, а именно, в области создания полифункциональных биодатчиков на основе жидкокристаллических дисперсий двухцепочечных нуклеиновых кислот.
Апробация работы- Результаты работы докладывались на различных международных, всесоюзных и всероссийских съездах, конгрессах, конференциях, симпозиумах, совещаниях и семинарах, в том числе: на I Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982), на XXII Съезде ФЕБО (Стокгольм, 1993), на II Съезде биохимического общества РАН (Москва, 1997), на Международном конгрессе "Взаимодействия нуклеиновых кислот" (Падуя, 1987), на I и III Международных конгрессах по биосенсорам (Сингапур, 1990; Новый Орлеан, 1994), на V Конгрессе европейского общества фотобиологов (Мар-бург, 1993), на IX Международной конференции по жидким кристаллам (Бангалор, 1982), на IV и V Конференциях социалистических стран по жидким кристаллам (Тбилиси, 1981; Одесса, 1983), на II Международной конференции "Молекулярная электроника и биокомпыоторы" (Москва, 1989), на III Конференции Италия-СССР по физике жидких кристаллов и лангмюровских пленок (Катания, 1990), на VII Между-
народной конференции Тетероциклн и оиоорганическая химия" і Сантьяго-де-Кампостелла, 1993), на XVI Международной конференции по фотохимии (Ванкувер, 189.3), на IV и V Всесоюзных конференциях по спектроскопии биополимеров (Харьков, 1981; 1984), на VI Всесоюзной конференции "Жидкие кристаллы и их практическое использование" (Чернигов, 1988), на Всесоюзной конференции "Новые направления биотехнологии" (Пушино, 1990), на Международном симпозиуме "Биомолекулярные структуры и взаимодействия" (Бангалор, 1984), на Международном симпозиуме "Физико-химические свойства биополимеров в растворе и клетках" с участием стран-членов СЭВ и СФРЮ (Пушино, 1985), на I и II Всесоюзных и III Всероссийском симпозиумах "Жидкокристаллические полимеры" (Суздаль, 1982, 1987; Черноголовка, 1995), на VI Всесоюзном симпозиуме "Конформационные изменения биополимеров в растворах" (Тбилиси. 1985), на II Российском симпозиуме "Новые методы биотехнологии растении" (Пушино, 1993), на Международном рабочем совещании СНГ-Германия по биосенсорам (Мюнстер, 1993), на Международном совещании по химии гидрогелей (Прага, 1995), на V Всесоюзном рабочем совещании "Жидкокристаллическое состояние в биологических системах и их моделях" (Пушино, 1986), на I Всесоюзном совещании по лиотропным жидким кристаллам (Иваново, 1990), на Международном семинаре "Малоугловое рассеяние рентгеновских лучей и нейтронов" (Пущино, 1985).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 44 печатных работы в ведущих международных и отечественных научных журналах.
Структура и объем диссертации, диссертация изложена на 321 странице, включающих 87 рисунков, 8 таблиц и список цитированной литературы, содержащий 243 ссылки. Она состоит из введения, десяти глав и выводов.
Во введении изложены цели и задачи проведенного исследования.
^