Введение к работе
Актуальность темы. В природе существует множество бактериальных и растительных токсинов, отличающихся многообразием функций, структуры и механизмов действия. Обширную и очень интересную группу среди них составляют бактериальные и растительные токсины, специфически ингибирующие синтез белка в эукариотической клетке. К этой группе относятся растительные токсины абрин (из семян Abrispre-catorius), рицин (из семян Ricinuscommunis), модецин (из корней Ас/ел/а c//gi/fafaX а также ряд токсинов бактериального происхождения: шига токсин (Shigella dysenteriae), псевдомонадный токсин A (Pseudomonas aeruginosa), дифтерийный токсин (Corynebacterium diphteriae). Данная группа токсинов представляетинтерес в силу своей высокой специфичности к рецепторам и внутриклеточным мишеням, что дает основание для их использования в терапии различного рода новообразований. Конъюгированные с антителами токсины (иммунотоксины) уже прошли ряд испытаний в лабораториях. Для подобного использования крайне важно знать особенности действия и транспортировки токсина в клетке.
Токсины этой группы используют для своей транспортировки в цитозоль мембранные структуры эукариотической клетки, и если часть из них ограничивается проникновением в эндосомы и оттуда в цитозоль (дифтерийныйтоксин);то для шига токсина была показана возможность "ретроградноготранспорта по аппарату Гольджи и эндоплазматическому ретикулуму вплоть до периплазмы ядра. Таким образом, мы имеем дело с прекрасными моделями для изучения транспорта белка в эукариотической клетке, для понимания роли специальных сигнальных последовательностей, а также возможности взаимодействия транспортируемых белков с внутриклеточными белками-переносчиками. Важность изучения шига и шига-подобных токсинов не ограничивается чисто академическими соображениями. По-прежнему представляют значительную угрозу вызываемые ими заболевания, исключительная способность бактерий кадаптации и появление новых патогенов. В1996-1997 годах в Японии, Шотландии и США зарегистрированы три серьезные эпидемии желудочно-кишечных заболеваний, вызванные штаммом Е. coil 0157/Н7. Эти широко распространенные бактерии производят шига-подобный токсин и характеризуются очень высокой патогенностью. В таких условиях, знание структурно-функциональных свойств токсинов оказывается незаменимым оружием в борьбе с заболеваниями.
Научная новизна работы. Все токсины, подавляющие синтез белка в эукариотической клетке, проявляют специфическую ферментативную активность по отношению к своим мишеням. Механизм действия
большинства токсинов хорошо изучен, и следующим вопросом в этой области может стать возможность регулирования их активности. В предлагаемой здесь работе изложены результаты структурно-функционального исследования регулирования ферментативной активности шига токсина. Впервые продемонстрировано существование механизма самоингибирования N-гликозидазной активности токсина. Методами химической модификации и сайт-направленного мутагенеза показано, что образующийся при протеолитическом расщеплении А субъединицы шига токсина фрагмент А2 взаимодействует с активным центром токсина. Это взаимодействие обеспечивается нековалентными связями между аминокислотными остатками, входящими в состав активного центра и фрагмента А2. Устранение взаимодействия приводит к возрастанию N-гликозидазной активности шига токсина в бесклеточной системе в 50 раз.
Во второй части работы показано, что протеолитическое расщепление А субъединицы шига токсина в аппарате Гольджи клетки-мишени необходимо для проявления его полной энзиматической активности. Таким образом, продемонстрирована связь между транспортом и активацией шига токсина в мембранных структурах эукариотических клеток. Практическая ценность работы. Продемонстрировано существование механизма регуляции активности шига токсина, а также зависимость его цитотоксичности оттранспорта и протеолитического расщепления в эукариотической клетке-мишени. Эти данные могут использоваться при работах с химерными вариантами токсинов в биомедицинских исследованиях, направленных на терапию раковых заболеваний. Апробация работы. Результаты доложены на II съезде Биохимического Общества РАН (19-23 мая 1997 г., Москва); на 3-й международной Энгельгардтовской конференции по молекулярной биологии (9-14 июня 1997, р. Волга); на студенческой сессии летней школы НАТО "Молекулярные механизмы липидного и белкового транспорта" (16-28 июня 1997, Каржиз, Франция); на 8-й Европейской конференции "Бактериальные белковые токсины" (29 июня-4 июля 1997, Штаффельстейн, Германия).
Основные положения диссертации обсуждены и представлены к защите на заседании коллоквиума лаборатории белковых ингибиторов клеточных процессов Института молекулярной биологии имени В. А. Энгельгардта РАН 23 октября 1997 г.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 98 страницах машинописного текста, содержит 4 таблицы и 16 рисунков. Библиография включает 172 ссылки.