Введение к работе
Введение. Транскрипционный фактор NF-кВ был впервые описан в 1986 году как активирующий белковый комплекс В-клеток, специфически связывающийся с участком ДНК в энхансере легких цепей иммуноглобулинов (Sen and Baltimore, 1986). Неактивный NF-кВ удерживается в цитоплазме другим белком, 1кВ, а после активации клеток высвобождается и транслоцируется в ядро. После клонирования генов, кодирующих субъединицы NF-кВ р50 и р65, оказалось, что оба белка содержат участок высокой гомологии с клеточным онкогеном c-Rel, его вирусным аналогом v-Rel и морфогеном дрозофилы Dorsal. Было показано, что этот участок полипептидной цепи отвечает за димеризацию (с различной эффективностью образуются как гомо-, так и гетеродимеры), связывание с ДНК и с ІкВа, природным ингибитором NF-кВ. Впоследствии было проклонировано и охарактеризовано еще несколько генов, содержащих участок гомологии с Rel, и несколько генов, гомологичных ІкВа (Рис.1). Было показано, что онкоген с-Rel обладает ДНК-связывающими свойствами, а гены, кодирующие р65 и предшественник р52 (lyt-ІО), часто обнаруживаются в точках хромосомных
c-Rel
12<П р-65 Щ
1263 р105
Транслоыдш
ядро
Активация
транскрипции
Р50 |-1267 р100-
р52 |-
Гомология с I-kB,
(удержание в цитоплазме)
Область гомологи
(связывание с ДНК,
димеризацня)
Процессинг предшественника
Рисунок 1. Схематическое изображение основных функциональных районов белков семейства NF-кВ/геІ. Зачерненными прямоугольниками показаны положения некоторых синтетических эпитопов, антитела к которым использовались для идентификации индивидуальных NF-кВ/геІ белков в настоящей работе.
транслокаций в опухолевых клетках,, то есть являются потенциальными онкогенами. И действительно, аномальная экспрессия различных членов семейства NF-кВ часто обнаруживается в опухолевых клетках. Функциональные участки связывания NF-кВ были найдены в промоторах большого числа генов, вовлеченных в функционирование иммунной системы. NF-кВ также принимает участие в регуляции транскрипции вируса иммунодефицита человека, действуя через сайты связывания в длинном концевом повторе вируса. Консенсус участка связывания NF-кВ имеет вид GGGRNNYYCC, однако последовательность некоторых функционально активных кВ сайтов может отличаться от консенсуса. Недавно предложена стандартизованная номенклатура белков NF-кВ/геІ (Табл.1); в этой работе используются, как правило, исторически сложившиеся обозначения (такие, как Р50, Р52, р65).
Сейчас известно, что белки семейства NF-кВ, первоначально обнаруженные в В-клетках, присутствуют в широком спектре клеток, как лимфоидных, так и нелимфоидных. В ответ на различные активирующие
1. Белки NF-кВ/геІ
2. ІкВ белки
Таблица 1. Номенклатура известных на сегодня белков семейства NF-кВ/геІ и их природных ингибиторов. (Nabel and Verma, 1993).
сигналы они транслоцируются в ядро, активируя гены, регуляторные элементы которых содержат кВ сайты. При этом действие NF-кВ обнаруживает высокую специфичность: в разных тканях активируются разные наборы генов. Вопрос о том, как контролируется эта специфичность, важен как для понимания фундаментальных закономерностей регуляции транскрипции у эукариот, так и для возможных практических подходов к лечению рака и СПИД. В научной литературе накоплено значительное количество данных в пользу того, что такой контроль может осуществляться на уровне (1) специфического воздействия активирующего сигнала на отдельные члены семейства NF-кВ, (2) избирательного узнавания NF-кВ белками кВ сайтов, имеющих вариации в нуклеотидной последовательности, (3) взаимодействия NF-кВ с другими ядерными факторами, (4) различий в пространственном расположении сайтов связывания NF-кВ и других транскрипционных факторов внутри данного промотора или энхансера. Однако общая модель действия факторов NF-кВ/геІ пока не построена, поэтому каждая NF-кВ зависимая система требует отдельного исследования.
Модельная система: гены локуса ФИО мыши. Локус ФИО мыши содержит гены фактора некроза опухолей (ФИО), лимфотоксина (ЛТ-альфа) и лимфотоксина-бета (ЛТ-бета, о существовании которого стало известно только в 1993 году), разделенных короткими (порядка 1 т.п.н.) межгенньши промежутками, содержащими несколько сайтов кВ (Рис.2). Для ФНО и ЛТ-альфа, первоначально охарактеризованных как цитотоксические факторы, продуцируемые, соответственно, активированными макрофагами и лимфоцитами, в настоящее время известен широкий спектр биологических активностей, включая активацию роста различных клеток. Считается, что эти два цитокина играют ключевую роль в функционировании и, возможно, развитии иммунной системы млекопитающих. Недавно открытый ЛТ-бета образует мембранный комплекс с ЛТ-альфа; о его функциях и регуляции известно значительно меньше.
Участие NF-кВ в регуляции транскрипции локуса ФНО было показано для
ЛТ-альфа ФНО ЛТ-бета
1 т.п.н. ^ 2а
і і
Рисунок 2. Карта локуса ФНО мыши. Показано положение сайтов связывания NF-kB. Стрелками показаны направления транскрипции генов, угловыми стрелками показаны промоторы.
гена ФНО и для гена ЛТ-альфа. Таким образом, локус ФНО представляет собой модель для исследования действия NF-кВ, интересную как с точки зрения фундаментальной науки, так и медицины.
Цель и задачи диссертационной работы. Целью данного исследование явилось изучение роли отдельных белков NF-кВ в регуляции транскрипции генов локуса ФНО. Были поставлены следующие задачи:
1. Разработать методику анализа тонкой структуры комплексов NF-кВ с
ДНК.
2. Выяснить белковый состав комплексов NF-кВ, связывающихся с
различными кВ сайтам из локуса ФНО в ядерных экстрактах из макрофагов и
лимфоцитов - тканей, где дифференциально экспрессируются гены ФНО и ЛТ.
-
Функционально охарактеризовать индивидуальные кВ сайты, из локуса ФНО мыши по способности активировать ген-репортер в модельной системе.
-
Изучить влияние белков семейства NF-кВ на конформацию ДНК в участке связывания, рассматривая потенциальные изменения как компонент транскрипционной активации.
Научная новизна и практическая значимость работы. Разработана методика высокоразрешающих нуклеопротеиновых гелей, позволяющая разделять комплексы индивидуальных белков семейства NF-кВ с ДНК. Охарактеризованы NF-кВ комплексы, образующиеся на кВ сайтах из локуса ФНО мыши, и показано, что белковый состав комплексов сайт-специфичен. Функционально охарактеризован новый кВ энхансер, находящийся за 3'-нетранслируемой областью гена ФНО. При помощи набора электрофоретических методов исследованы конформационные изменения ДНК в участке узнавания и связывания NF-кВ. Показано, что разные NF-кВ белки в различной степени изменяют конформацию ДНК в участке связывания.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на следующих международных симпозиумах: 2 Международной конференции по цитокинам (Хилтон Хэд, США, декабрь 1989); Советско-германском симпозиуме по молекулярной биологии (Иркутск, 1989); Симпозиуме Общества Биологии Лейкоцитов (Колорадо, США, 1991), Германско-российском симпозиуме по молекулярной биологии (Констанц, Германия, июнь 1991); Российско-Германском симпозиуме "ДНК-белковые взаимодействия: структурные и фармакологические аспекты" (С.-Петербург, август 1991); Кистоун Симпозиуме "Транскрипционная регуляция при развитии, дифференцировке и заболеваниях" (Тамаррон, США, январь 1992); Гордоновской конференции "Ядерные белки, регуляция экспрессии генов и структура хроматина" (Тилтон, США, июль 1992); 1 Международном Симпозиуме "СПИД, рак и ретровирусы человека" (С.-Петербург, ноябрь 1992); Кистоун Симпозиуме "Транскрипция: факторы, регуляция и дифференцировка" (Кистоун, США, январь 1993); 58 Кодд Спринг Харбор Симпозиуме по количественной биологии (Колд Спринг Харбор, США, июнь 1993); 2 Международном Симпозиуме "СПИД, рак и ретровирусы человека" (С.-Петербург, ноябрь 1993), а также докладывались на
семинаре "Хромосома" (1991 г.) и конкурсе научных работ Института Молекулярной Биологии им. Энгельгардта РАН (1994 г.).
Публикации. По материалам работы опубликовано 5 статей в отечественных и зарубежных журналах и книгах, а также тезисы в материалах 4 международных конференций.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на страницах
машинописного текста и состоит из следующих частей: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, полученные результаты, обсуждение результатов, выводы, список литератур. Библиография включает
отечественных и зарубежных источника, работа проиллюстрирована рисунками и таблицами.