Введение к работе
Актуальность проблемы. Одной из наиболее важных задач молекулярной биологии является изучение механизмов экспрессии генетической информации. Ключевой этап этого процесса - транскрипция - заключается в комплементарном синтезе РНК-транскрипта на ДНК-матрице. Бактериальный транскрипционный цикл удается целиком осуществить в простой бесклеточной системе, состоящей из ДНК-матрицы, очищенной РНК-полимеразы и рибонуклеотидов, без каких бы то ни было дополнительных белковых факторов. Тем не менее, РНК-полимераза не является единственным белком, участвующим в транскрипции in vivo. В ней также участвуют разнообразные регуляторные и вспомогательные белки, изучение которых важно для детального понимания процесса транскрипции в живой клетке. В процессе удлиннения транскрипта РНК-полимераза движется по ДНК-матрице с непостоянной скоростью. В некоторых участках матрицы длительные задержки в продвижении РНК-полимеразы, так называемые паузы, наблюдаются даже при оптимальных концентрациях субстратов. РНК-полимераза может также попадать в элонгационные "тупики" - состояние, при котором, несмотря на целостность тройного злонгационного комплеса (РНК-полимераза/ДНК-матрица/РНК-транскрипт), полностью блокируется нормальный процесс удлиннения РНК. Гомологичные бактериальные белки GreA и GreB, недавно идентифицированные у Escherichia coli (Borukhovet al,, 1993), представляют собой новый класс транскрипционных факторов, способных предотвращать паузирование и образование "тупиковых" комплексов, а также уменьшать число ошибок при синтезе РНК (Erie et al., 1993). Действие этих белков состоит в индукции реакции расщепления РНК-транскрипта, обнаруженной ранее в элонгацион'ных комплексах РНК-полимеразы Е. coli (Surratt et al., 1991). Эта реакция заключается в отщеплении и диссоциации З'-концевого фрагмента РНК длинной в 2 -18 нуклеотипов из злонгационного комплекса с последующим возобновлением транскрипции с вновь образованного З'-конца РНК-транскрипта, что дает РНК-полимеразе повторную возможность преодолеть тупик или паузу, а также встроить в РНК правильный нуклеотид. Биологическая важность данного типа реакции отражена в ее эволюционной консервативности: недавние работы показали наличие транскриптрасщепляющей активности в элонгационных комплексах вирусной РНК-полимеразы (Hagler et al., 1993) и эукариотических РНК-полимераз II и III (Reines et al., 1992; Izban et al., 1992; Whitehall et al., 1994). Таким образом, изучение транскриптрасщепляющей активности в транскрипционных
комплексах РНК-полимеразы Е. coli представляется актуальным.
Цель и задачи исследования. Целью работы являлось детальное изучение структурно-функциональных свойств транскрипционных факторов GreA и GreB и индуцируемой ими транскриптрасщепляющей активности в тройных элонгационных комплексах (ТЭК) РНК-полимеразы E.coli.
В работе ставились следующие задачи. 1) Сконструировать мутантный greA' greB' штамм Е. coli. Исследовать клеточный лизат этого штамма на присутствие дополнительных Gre-подобных факторов. В случае отсутствия таковых - исследовать РНК-полимеразу, выделенную из greA" greB" мутанта, на наличие собственной транскриптрасщепляющей активности. 2) Сверхпроду-цировать и очистить белки GreA и GreB, детально охарактеризовать их физико-химические свойства. 3) Методом фотохимического сшивания с использованием фотоактивируемых аналогов нуклеотидтрифосфатов продемонстрировать связывание GreA и GreB белков с РНК-транскриптом в тройном элонгационном комплексе. 4) Сконструировать серию реципрокных гибридов между генами greA и greB и сверхпродуцировать кодируемые ими химерные белки. Исследовав последние на тип индуцируемой транскриптрасщепляющей активности, определить, какие участки аминокислотной последовательности GreA и GreB отвечают за их функциональную специфичность. 5) Провести крупномасштабное выделение белка GreA как дикого типа, так и модифицированного Se-Met, для последующего рентгеноструктурного анализа.
Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые показано, что в составе ТЭК РНК-полимераза Е. coli обладает, помимо полимеризующей и пирофосфоролитической активностей, третьей - транскриптрасщепляющей (эндонуклеазной) - активностью. Эта активность может быть индуцирована в отсутствие GreA и GreB факторов слабощелочными рН. Впервые детально охарактеризованы физико-химические и структурные свойства GreA и GreB, в том числе показано, что GreA и GreB контактируют с З'-концом РНК-транскрипта в составе ТЭК, и идентифицированы участки полипептидной последовательности GreA и GreB, участвующие в этом контакте. Также установлено, что функциональная специфичность GreA и GreB определяется их N-концевыми доменами. Создан штамм-продуцент и осуществлено крупномасштабное выделение белка GreA как дикого типа, так и модифицированного Se-Met, что позволило провести рентгеноструктурный анализ GreA.
Поскольку реакция расщепления транскрипта наблюдается в процессе транскрипции как у прокариот, так и у эукариот, полученные в данной работе результаты служат пониманию базисных аспектов транскрипции.
Апробация работы. Основные результаты работы представлены на Международной конференции FASEB "Регуляция инициации транскрипции у прокариот" (1993, США), на Международном симпозиуме "Молекулярная и клеточная биология" (1994, Кистоун, США), а также на семинаре Отдела биотехнологии ГНИИгенетика.