Введение к работе
Актуальность темы. На протяжении многих лет и по настоящее время в ведущих лабораториях мира проводится создание плотной панели генетических маркеров и STS (sequence tagged sites) хромосомы 13, которые успешно применяются как для локализации генов наследственных заболеваний, так и при построении интегрированной карты этой хромосомы. Применение микросателлитов для создания генетических маркеров чрезвычайно эффективно в связи с: а) их повсеместным распространением в геноме млекопитающих; б) высокой гетерозиготностыо и информативностью; в) существованию простого и универсального способа идентификации (на ДНК клонов, на геномных ДНК и ДНК клеточных линий). В последние годы для создания новых полиморфных маркеров, кроме динуклеотидов, все более широкое распространение стали получать микросателлиты три- и тетрамерных мотивов. Благодаря большей длине звена применение тримеров и гетрамеров позволило увеличить разрешающую способность анализа шлельного полиморфизма, повысить достоверность результатов и /простить методику, заменив радиоактивную метку окрашиванием фрагментов ДНК серебром. Эти преимущества три- и тетра-гуклеотидных маркеров открывают перспективы для их применения і клинической практике для целей диагностики и прогнозирования іаследственньїх заболеваний, а также для идентификации личности в еномной дактилоскопии.
Цель и задачи исследования: Настоящая работа посвящена нализу распределения микросателлитов ряда мотивов на хромосоме 3 и созданию генетических маркеров и STS на основе отобранных окусов. Для достижения цели работы были поставлены следующие здачи:
1 - отбор космид, содержащих тетрануклеотидные повторы,
з клонотеки хромосомы 13 по гибридизации с олигонуклеотидными
)ндами;
2 - анализ отобранных космид гибридизацией по методу
аузерна;
-
- субрегиональная локализация позитивных космид ш метафазных хромосомах методом флуоресцентной гибридизации і условиях in situ (FISH);
-
- реклонирование отобранных космид с применение\ плазмидных векторов;
5 - определение нуклеотидных последовательностей
повторов и уникальных участков, фланкирующих микросателлиты
синтез праймеров, комплементарных этим последовательностям;
6 - анализ аллельного полиморфизма локусов і
использованием представительной выборки (30-140 неродственны;
индивидов);
7 - анализ возможностей применения новых маркеров дл;
локализации генов заболеваний в области 13q и в исследованиях щ
типированию личности.
Научная новизна и практическая ценность работы. Настояща] работа выполнена в рамках проекта "Картирование хромосомы 13' ГНТП РФ "Геном человека", при участии сотрудников лабораторий возглавляемых д.б.н. В.М. Захарьевым, проф. А.В. Зелениным (ИМІ РАН), проф. Н.К. Янковским (ИОГен РАН) и член-корр. РАН А.П Рысковым (ИБГ РАН). Данная работа является частью комплексны: исследований, проводимых в лаборатории молекулярної диагностики и геномной дактилоскопии ГНЦ "ГосНИИ генетика" направленных на поиск высоко информативных микросателлитов і геноме человека и их применение для локализации геної распространенных наследственных заболеваний, в диагностике и прі идентификации личности.
Проведен скрининг упорядоченной клонотеки хромосомы 1; с применением плотных панелей клонов, что позволило провесті статистический анализ данных. В результате изучены особенності распределения три- и тетрануклеотидных микросателлитов н; хромосоме 13 и выбран единственный мотив из 7 исследованных применимый для картирования хромосомы 13 и други; ядрышкообразующих хромосом - 14,15, 21 и 22.
Созданы новые полиморфные маркеры и STS в области 13q которые не были идентифицированы ранее в других Научны: центрах, в том числе зарубежных. С применением панели YAC-o: (СЕРН) детально определена локализация полиморфного локус; D13S699 (13ql4, 28сМ от pter-конца), для которого получень предварительные данные о его возможной ассоциации
изофренией. Высокоинформативный маркер D13S699 успешно зименен в судебной медицине для решения вопросов о спорном гцовстве.
Апробация результатов и публикации. Результаты настоящей іботьі докладывались на 4-ой и 5-ой Конференции "Геном человека" [ерноголовка, 1994 и 1996 г.), Международной конференции Молекулярная биология накануне XXI века" (Москва, 1994 г.), 1-ом :ероссийском съезде медгенетиков (Москва, 1994 г.), 27-й и 28-й онференциях Европейского общества генетики человека (Берлин, 95 г. и Лондон, 1996 г.), 3-м Международном рабочем совещании ) хромосоме 13 (Агенда, США, 1995 г.), 3-й и 4-й Конференциях Щ "ГосГНИИ генетика" (1995 и 1996 г.), на Международной энференции "Геном человека" (Гейдельберг, 1996 г.). Материалы іссертации опубликованы в 2 статьях и 9 тезисах.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа
ложена на страницах машинописного текста и состоит из
едения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения зультатов, выводов и списка цитируемой литературы.