Введение к работе
., і
... .. - - Актуальность проблемы.
'"""'"Клойировакле генетического материала, введение его в рещши-інтиме клетки и экспрессия, осуществляются с помощью векторных истем. Развитие генетической кнзхенерии неразрывно связано о детальним изучением свойств векторов,а создание новых секторов ос-:і:ется одной из важнейших задач в этой области исследований.
В зависимости от поставленных задач используются различные шстемн для клонирова-шя, экспрессии генетической информации, )дно- или двурепдиконные, интсгративние, зписошне инкапсвдируга-гиеся и т.д. К векторам для клонирования предъявляются такие тре-Зованля как небольшой размер, репликация под ослабленным контро-І9М, наличке надежного селективного маркера.
13 геииотигепарявх эксперимента;-: глтрэко используются плазш-щ, сконструированные на основе репликона рМІЗІ, снабженные мар-cepoiiti ус той тип с с ти к. 2-3 антибиотикам. Кагэднй из маркеров содержит единственной участок узнавания специфической рестршмтпепной эндонуклеазой, При встройке 'фраімонта гетерологнчной ДШС по одному из чК"і>: участков маркер будет л'."активирован. Селекштю клеток, несущих глбркдиую кочетрупалм, оормо оголяет в два атака: сначала отбирают клопы бактерий но признаку цитатного маркера, а затем проводят селекцию кленов у кетогчх функция гона.ииюль- . зеванного для встройки, нарушена вставкой.
Наличие довольно протяженной нуклеотпдной ігаслоцоватольпос
та KO"Mn''"'''>'"'fit' '"'"ГМ-Ч"!' 0^004^7^7411-11,4.40 7^4^07^4^44077, Т'лт1ЗбР,"НО
ведет к увеличена*'} молекулярной мас ем рск'-мбпі'антной ЛІК, что з . ряде случаев пекалателыго, В то то время, для рзилк-тагг'н илазмид типа рШ[-Со1ЕХ достаточно участка, генома примерно 650 пар нук-леоткдов (Кіг.ига fit al ., 1902),
В связи с зимі особпн интерес представляют данные (llljfaohecu кй ib зі», 1979 ) о бактериальной плазмидэ рОаГг, которая способна сообщать клеткам фенотип Ga.L+ ; бактариа B.coli , несущие * эту юіазмиду, жизнеспособны только в тотл случао, если в ншс присутствует другая плазмида, рМВЭ. Следовательно, селекцию бактерий, несущих плазмида, сконструированные на основе решшкена pMBI, мояно проводить на принципиально новой основе - использовании ограничения цитотоксических свойств плазмида pGall.
Цели и задачи исследования
Цель-исследования - изучить способность ко>лпенсации цитотоксичного действия плазмиды pGall на хозяйскую клетку различ-ншли плазмвдаш, сконструированными на основе репликона pMBI; разработать новый подход к селекции бактерий в.соїі, несущих "безмаркерние"плаз.\шдц, на основе компенсации цитотоксичного действия плазщщц pGall; на основе репликона рГ.-ІВІ сконструировать вектор, несущий онкоген малоизученного бычьего аденовируса третьего типа, который мокко использовать для изучения системы селекции на основе плазмидц pGai.1.
Для достижения этих целей били поставлены следующие задачи:
1. Определить связь цитотоксичного действия плазшды pGall,
на хозяйскую клетку, с синтезом нормальных продуктов оиерона
тетрацшлинрезистентностп сосуществующей плазмида.
2. Исследовать свойства совместимости плазмиды pGail с
'другими плазмидами сконструпрсзаннпмп на. основе репликона рШ1.
. 3. Подучить и клонировать фрагмент ДІЙ бычьего аденовируса третьего типа, способный трансформировать клетки эукариот.
' ' Научная новизна исследования
В результате проведенной работы впервые создана система се-
. лекции клонов Е,ооіі несущих'" безмаркерше " плазмиды, сконструированные на основе реллшеояа pMBI; определена возможность использования этой систем селекции. Изучен механизм цитотоксичного действия плазмида pGall . Показало, что у нлазмкд сконструированных на основе репликона pMBI свойство совместимости овязако с участком ДНК не относящимся к"мшшмслькому" реплико-ну, и. определено, что этот участок не ограничивается областью расположенной от огі до участка узнавания рестриктазой rvuii плазмиды рВЮ22 . На основе онкогена бычьего аденовируса третз его' типа сконструирован новый траисфорілирущнй вектор. При кло-
. нироваяии фрагмента вирусной ДНК была обнаружена гетерогенность вирусных геномов популяции; клонирована и охарактеризованы две
. форш ояквденсодвржащего фрагмента генома.
: ' 2
Практическая значимость ра.боты
Разработаннач система селекции е. сои , несущих " безмар-герше " плазмпда, сконструированные на основе реплшсска рШЗІ, юзБоляет производить близкий к 100% отбор клонов бактерий в ген-юиняенершх экспериментах. Связь со свойством совместимости участка, не относящегося к " минимальному " решшкоку, плазмид, сконструированных на основе ренликона pMBI, необходимо учитывать ари конструкции новых векторов и создании бактериальных гат амілоз. Энкоген малоизученного бичьего аденовируса третьего типа - это новый маркер для эукариотических векторов, обеспечивающий трансформированный фенотип клеток. Векторы, сконструированные на основе этого онкогена могут быть использованы в генноштазнерной практике для внесения чужеродной генетической информации, а такие для изучешія особенностей взаимодействия онкогена вируса с клетками зукариот.
Апробация работы и публикации результатов исследования.
Материалы диссертации доложена и обсувденн на конференции по программе АМН СССР " Ген " ( 1982 г.), на Всесоюзной конференции: " Рэкомбинантные ЛНК " (Гїущяно, 1982 г.), на заседании Ученого совета кафедры вирусологии биологического Факультета Московского Государственного университета им. М.В.Ломоносова { 1983 г. ), на итоговых научных конференциях лаборатории биохимии вирусов Института вирусологии ш. Д.Я.Ивановского АШ СССР ( 1982,1983 гг.), да. конференции отдела кинетики яишпосіспх и биологических процессов Отделения Института химической физики АН СССР ( 1985 г.).
Основные положения диссертации изложены в 3 печатных работай.
Структура и объем работы