Введение к работе
Актуальность темы. Азотфиксирующий симбиоз клубеньковых бактерий с юбовыми растениями является удобной моделью для изучения различных .аспектов ізаимодействия про- и э>карнотических организмов, таких как специфическое узнавание имбионтов, индукция и морфогенез клубенька, и, наконец, фиксация молекулярного азота. Іримемснис современных методов молекулярной биологии и генетики позволило становить, что в основе симбиотнческих взанмоотногч<:ннй лежит обмен сигналами между имбионтами, приводящий к координированной экспрессии целого ряда генов как у астений гак и у микроорганизмов. К первым сигнальным факторам относят актернальные липохнтоолигосахариды (Nod-факторы) и растительные флавоноиды. Іменно их синтез определяет специфичность взаимодействия и индукцию ифференцировки растительных клетокна ранних этапг.х симбиоза.
К настоящему времени накоплен большой экспериментальный материал, видетельствуюшин о том, что в процессе формирования сгмбиотических систем частвуют различные классы полисахаридов ризобий. Особая роль в этом процессе і водится кислым экзополисахарпдам (ЭПС). Предполагается, что они могут пособствовать прикреплению ризобиальных клеток к поверхности корневого волоска, частвовать в образовании матрикса инфекционных нитей, предохранять бактерии от пцитных реакций растения-хозяина и физиологического стресса, обуславливать тецнфнчность взаимодействия микро- и мгкросимбионтов. Более гого, пзкомолекулярные фракции ЭПС, по-видимому, можно рассматривать как сигнальные акторы, обеспечивающие успешную инглзию клубеньков бактериями и развитие ютфиксирующпх бактероидов. Необходимо отметить, что имеющаяся в настоящее время [формация о роли ЭПС в симбиозе базируется в основном на изучении симбиогичестсоп ютемы Sinorhizobium meliloli - Medicago saliva. Данные о генетическом кон фол; юсинтеза ЭПС у других ризобий весьма малочисленны и фрагментарны. Однако в кледнее время появляется все больше сведений о том, что закономерности, выведенные і основании изучения только указанной модельной системы, не носят универсальною ірактера. Следует также отметить, что даже в случае симбиоза S. meWoti н М. ші\>а пекулярные механизмы специфичности и сигналннга с участием ЭПС далеки от своего іяснения.
Данная работа посвящена изучению генетического контроля биосинтеза ЭПС у убеньковых бактерий Rhizobium leguminosanim. Выбор этого объекта исследований был условлен следующими обстоятельствами. Во-первых, данный вид ризобий является асспческим объектом, на котором были получены основные результаты, касающиеся >лекулярных механизмов формирования симбиоза. Во-вторых, как и в случае S. meliloti,
образование клубеньков на растениях идет по недетерминированному типу и, каї
полагают, зависит от синтеза ЭПС. Кроме того, нарушения в синтезе ЭПС у выбранноп
нами штамма R. !. bv. viciae VF39 по-разному влияют на характер взаимодействия і
растениями-хозяевами. Следовательно, данный объект является удобным для изучени
вопросов, связанных участием ЭПС в детерминации специфичности симбиоза.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось идентификация і
проведение детального структурно-функционального анализа генов, контролирующи:
биосинтез ЭПС у R. I. bv. viciae VF39. Исходя из этого, в работе последовательно ставилис:
следующие конкретные задачи:
-
Локализовать и клонировать область генома штамма R. I. bv. viciae VF39 содержащую генетический локус биосинтеза ЭПС.
-
Определить нуклеотщщую последовательность генов биосинтез; экзополисахарида и изучить экспрессию индивидуальных генов в клетках Е. coli.
-
Изучить влияние мутаций в индивидуальных генах pss на продукцию кислой экзополисахарида у R. I. bv. viciae VF39.
-
Клонировать и определить нуклеотидную последовательность гена pssB R. I. bv viciae VF39.
-
Изучить роль гена pssB в свободноживущих клетках ризобий и в процесс формирования симбиоза.
Научная новизна работы. Полученные в ходе данной работы результаты нося' приоритетный характер. Идентифицирован новый кластер генов биосинтез; экзополисахарида у R. I. bv. viciae и определена их нуклеотидная последовательность. Н; основании выявленной гомологии белковых продуктов pss-генов с непроцессивньїмі гликозилтрансферазами, а также фенотипического проявления мутаций, подтверждеш участие семи из идентифицированных генов в биосинтезе ЭПС. Клонирован і секвенирован ген pssB R. I. bv. viciae. Показано, что продукт этого гена может быть отнесеї к семейству белков про- и эукариотического происхождения, ГОМОЛОГИЧНЫ) инозитолмонофосфатазе млекопитающих. Получены экспериментальные доказательств; того, что ген pssB не участвует в процессе биосинтеза ЭПС, как ранее предполагалосі Бортакуром и соавт. (Borthakur et al., 1988), а представляет собой неидентифицированньїі ранееуЬс-ген.
Практическое значение работы. Настоящая работа относится к числ; фундаментальных исследований. Однако, учитывая тот факт, что использованиі клубеньковых бактерий в практике сельского хозяйства является экологически чистым і высокоэффективным способом внесения азота в почву, понимание молекулярньп
з ;ханизмов функционирования азотфиксирующих симбиотических систем может
юсобствовать конструированию хозяйственно-полезных штаммов клубеньковых
іктерий, в частности, штаммов с повышенной конкурентоспособностью и расширенным
>угом инфицируемых бобовых. В связи с этим, особое значение для разработки методов
шструирования приобретают исследования по изучению генетического контроля
юсинтеза различных классов полисахаридов у ризобий, а также выяснению их истинной
>ли в формировании азотфиксирующего симбиоза.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на :ждународных и Всероссийских конференциях: 1st European Nitrogen Fixation Conference id Workshop on "Safe application of genetically modified microorganisms in the environment" ^егед, Венгрия, 1994 г.), 9-м Баховском коллоквиуме по азотфиксации (Москва, 1995 г.), lh International Congress on Nitrogen Fixation (Санкт-Петербург, 1995 г.), "Биосинтез и :градация микробных полимеров. Фундаментальные и прикладные аспекты" (Пушино, '95 г.), 2nd European Nitrogen Fixation Conference and NATO Advanced Research Workshop Jiological fixation of nitrogen for ecology and sustainable agriculture" (Познань, Польша, 1996 ), втором съезде биохимического общества РАН (Москва, 1997 г.), П открытой городской іучной конференции молодых ученых г. Пушино (Пушино, 1997 г.), а также на ежегодной іссии Ученого Совета ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН, посвященной подведению итогов жкурса научных работ (Пушино, 1996 г.).
Публикации. Основное содержание работы изложено в пяти статьях.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы,
зтериалов и методов, результатов исследования, обсуждения, выводов, списка
:пользованной литературы. Диссертация изложена на страницах машинописного