Введение к работе
Актуальность сомы. Шихиматний биосиптетичесгай путь является основним источником образования ароматических соединений из карбогидратных предшественников в яявой пріфоде. Конечными продуктами данной разветвленной ідопи биохимических реакций являются в частности ароматические г'ішюкпслоти (фотилаланші, ілрозш, трттофоп), а такта ряд важнейших метаболитов ароматической природи, таких кеч гг.'тсіпти Е и К, фолнввая кислота, :'бихшол ц нластохшюн. itoicovjpio гюталлохелата (затврохолад). Поречислензшу T.j'DT вещества за стсу.'отошвы тирозина, образующийся только в клотких мнкроорганизмои и растений, относятся к группе пезс!іе,тнмнл фактурой питания. Учиппзпп важность перечислеших Еілпа соедипвшМ .«рематической природи для мздщшш, гэтеринарта п сельского хозяйства, били,, разработан»! njcгЬ'ієпт.:;; технология получения дыших веществ.с использованием »'и^р^;ргошгемов. Срэди использующихся дли этих целей различных впцек бактерий штамчн бацилл, в частности u. r.uotius, обладают, па пзш взгляд, определенными преимуіийствавд: разработаны технологии крупномасштабного выращивания биокассы и наделения "продуктов; штаммы в. subtnis безопасны с точки_ зрении экологических требований ; по степени изученности с молекулнрпо-бяологичоской и
ГеНЭТЯЧОСКОЙ ТОЧеК ЗреїШЯ ОТОТ ГрГЯІШЗІІ УСТуПРеТ ТОЛЬКО Е. с->1 і .
Организация иикиматиого Оні.синтєтіг'єсііс"', дути у в. subniis обладает рядом характерних особенностей. Ушшальїшг.і отличием,
ОПИСаНЩШМ Bentley, R. 10WO, іШЛЯО'і'СЯ СУЕ.ЄСТВОВатгаС у В.subtilis
168 полиферментного комплекса, вклзгш.^его Л4ГФ-сіштазную, хоризматмутазную и вжпшаткипазпур активности. Пе різно две фермеїггатшзтга активности расположена на одноі шлшептидноА цепи и кодируются a-cA-aroG геном. ДАГФ-сйнгазэ >.тест особое 31ШЧЄІШЄ поскольку катализирует первую реакцию мчгабоїіиоского таикимапгого пути. Хоризчятмутаза, катализирующая пріі«*й'снио хсризмоть в префонат, обуславливает разделение общего бю'.'^тетическогс ігггока на отделыше пути Оаосиптеза: тиросина я -|р"ч^о^аяана, трілітоЛ^чл и изохоризмата. В отличии от ;уГФ-синтаз др; гчх широо^геюгиог. я
растений, ИИГИбИруЮЩИХСЯ ПО ІфИНЦИПУ 06pC'f!,.\< СВЯЗИ ОДН'.Л Н.|.~
несколькими ароматическими аминокислотами, ДАТч-:*«яїєз:; f". ?cbti:.is
168 ингибируегся двумя интермо пиаТ-ІІ nfOXTTlfeCiVirO
Олосшиїггаческого пути: профопатом и хоріїзматом.
По дашіим биохимических исследований, прэдставлоннпх
Llewellyn, D. el al. 1980, ДАГФ-СШТаЗа ИЗ ШТЭММа B.subtiiis kTr.Z
0051 Marburg, ИСХОДНОМ ДЛЯ D.subtil is 168, ЯВЛЯОТСЯ
нонофуншчаоиалыгой. кодируется aroA геном u отличается по ряду параметров ингиблрования.
Прикладные задачи, связаннее с повышением продуктивности шташюв-продуцонтов ароматических аминокислот, могут бить решены путем увеличения эффективности экспрессии генов, кодирующих фермент» "ключевых" этапов биосинтеза. Для биосинтеза ароматических аминокислот у B.subtiiis такими ферментами на сегодняшний день принято считать ДАГФ-синтазу, хоризматмутазу и првіинатдвгидратазу (для фенилаллшша). Использование шсокоэффоктивних, охарактеризованных в клетках бацилл промоторов, а такжэ объздишшю ''ключевих" гонив биосинтеза в едашю структури искусственных опоронов под контролем "сильных" промоторов, можот бш'ь перспективным подходом в решении подобних -прикладных 'проблема.
Таким образом, уникальные особенности ДАГФ-синтазы
ХОрИЗМаТМутаЗЫ B.subtiiis 168, СУЩЄСТВЄШШ0 ОТЛИЧИЯ У 0Н8Л0ГИЧИ0Г0 ОеЛКЭ ИЗ ИСХОДНОГО рОДИТеЛЬСКОГО ШТаММа B.subtiiis АТСС G0S1
Marburg, а тагсш практический интерес, обусловивший использованием свойств данного фермента при получении штаммов-продуцвнтов ароматических пмппокислот, опрелзлили наш интерес к изучению структурно-функциональн;?х характеристик
aroA-aroG И агоА ГЄПОВ, КОДИРУЮЩИХ ЭТИ бвЛКН.
Цель и задачи исследовашш. Цзлью работы было нзучегав структури,
СВОЙСТВ И ЭКСПреССИИ aroA-aroG Г0Н8 B.subtiiis 168 И аго/. ГЄНЛ B.subtiiis АТСС 6051 Marburg.
Для осуществления поставленной цели решали кладущие задачи:
- определение первичной нуклвотидной последовательности ГРИВ
aroA-aroG В.subtllls 168;
- ИЗуЧЭНИе организации ПрОМОТОрНОЛ ОбЛаСТИ ГОЯа arcA-aroG
B.subtiiis 168;
СраВНа'ГеЛНШЙ аНаЛИЗ СТРУКТУР aroA-aroG ГЭН8 B.subtiiis 168 и агоЛ Геїіа B.subtiiis АТСС 6031 Marburg;
изучение свойств экспрессионной единиц» EUlsoas из области
реїшсгзцпа стрептококковой плвэчидн ремюозз;
- изучение экспрессии гона ДЛГФ-синтазм хорззматмутязп в. subtiu =
ПОЛ КОІГГрОЛОМ ПЛЭОЗЗ;
- получение шіззмид, содзряащих лишенный собственного промотора
ГЄН aroA-aroG И pheA ГСП В. amyloliqusf acions ІЗ СОСТВВЭ НСКУССтаеШШХ ОПОрОІЮВ rplU-orfX-rpmA'-aroA-aroG-pheA;
- кселодсвэнлэ экспрессии гена ДАІФ-сиитази ' лорчзм'їтмутазн
в. subtxiis пол 'контролем промотора \ рпоосималыгого
ОПврОНа rplU-orfX-rpmA" И. arnylol iquef acier.-, ;
- изучепи? влияния различна. фактзров па оі^иктіилюсть зксиресснч
агоА-аг/3 ҐЗІІЗ U ГОСТ0ПЄ ИСКуССїНОННОГО ОПОрМІІЗ.
Hay г а л новизні. и практическая значимость. Определена пзрончна.ч
НуШЮОТЛДТ'Л НОСЛРДОИаТеЛЬ^ОСТ'і ГОНП агоА-aroG D. subLilis IG3,
кодирующего би^ункционолышй іІяр?.!еігг шшг.імагіюго биосіштотнчоского
пут;' ДАП>-сицтззу торгамагаутазу. Охарактеризовала
СТруКТуріІ0-:ТуН!',_г;Г01іаЛЬиаЛ СрГіЛШЗаЦИЛ Продукта ГОНа лгоА-aroG;
обнаружил определенная гомология м-концвізой частя бифункционального фзрмэпта с хоризматмутааїшгяі частями Сожов,
КОДИруСГЛХ tyrA И pheA ГОПЗМЛ Е. eeli It aroll ГВЦ0М B.subtilis АТСС
cost Marburg; виявлена существенная гомология с-коіщзЕОІІ частя ДАГФ-сшітази торгсзматмутазн с. белком ДМОФ-сшпазоЯ е.соіі, катализирушіїгї аналогичную с ДАГФ-сштсзол в. subtius реакция альдолыюй конденсации, но вевлвчешим d путь биосинтеза клеточной станки е. сон . В результата клонирования и сеїшвшіроваипя показана функциональная и структурная идентичность продуктов готов
aroA-aroG B.subtilis 168 И aroA ГвНЭ B.subtilis ЛТСС 8031
Marburg. Определена точка старта транскрипции и предполагаемая
Организация ПрОИОТОрНОЙ ОбЛаСТИ ГОНа aroA-aroG в клотяах
Q.subtiiis. Охарактеризована зкепресецоннал единиц*] ешэозз из области репликации строптококковой плаз'лчдч рбшэозз. епійозз
ИСП0ЛЬЗ"ВаНа При Tt.jym'Tfl' ЗКСПреССИИ aroA ГОНОП I<4.t ЇІ Marburg
штаммов B.subtins. Реализована задача конотруіірования искусственного onjpoiia, ссдіфжащего рмт, генов луїн биосинтеза
ЗеїШЛалаНИИЯ: aroA = : оО Г!Л; B.subtilis it pheA ГВЦ
в. at-yit-Hqi >(»-iens под контролем промотора рабосомалыюго оптрона
rpiU-i.,-rXr-ртпЛ В. amyloliqo6>f асі ens. ГіО.лу",;<;jііНП В рабОТО Ш1ЯЗТЯДИ,
содрр:;а№к" аИвктивк'} зксмрессируї." \"Лс:і ген ДАГф-счт;!гц
хорнзматмутазн, могут бить использованы при конструировании штаммов-продуцентов ароматических аминокислот.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из слэдухщих разделов: введение, материалы и методы, результаты и обсуадения ( U глав), вывода, список литературы ( {& наименования); и содержит ^Орисупков и f/таблнц. Объем работы -92.с.