Введение к работе
Актуальность темы. В последние годы успешно развиваются структурно-функциональные исследования низкомолекулярных (молекулярная масса 12-13 кДа) внеклеточных рибонуклеаз из рода Bacillus. Внеклеточные РНКазы микроорганизмов относятся к классу циклизующих гуанилепецифичных ферментов, характеризуются высокой степенью гомологии первичной и пространственных структур и обладают заметным функциональным сходством. Семейство этих белков являются идеальной моделью для изучения взаимосвязей структура - функция и структура - стабильность, а также при изучении основных принципов сворачивания белков.
Наиболее изученными среди рибонуклеаз микроорганизмов являются РНКазы барназа Bacillus amyloliquefaciens (Ва) и блназа Bacillus intermedins 7Р (Ві), трехмерные структуры которых известны с высокой степенью разрешения (1,4-2А). Эти РНКазы являются близкими природными гомологами, продуктами естественного мутагенеза (гомология первичной структуры составляет 85%). Белки имеют очень сходную вторичную и третичную структуры, а основные цепи практически идентичны. Однако, обнаружены серьезные различия в их ферментативных свойствах и стабильности. Изучение точечных мутантов барназы с заменами в тех позициях аминокислотной последовательности, где эти РНКазы различаются, не дало исчерпывающего ответа на вопрос, какие из этих аминокислотных остатков (а. о.) определяют индивидуальные свойства биназы или барназы. Дополнительная информация может быть получена при использовании иного подхода к изучению структурно-функциональных отношений в гомологичных белках. Этот подход связан с созданием гибридных белков на основе высокогомологичных родственных белков. Функциональную значимость аминокислотных остатков, по которым эти родственные белки различаются, можно установить, исследуя свойства гибридных белков и белков дикого типа.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось создание и изучение свойств гибридных белков, составленных из различных частей молекул РНКаз барназы (Ва) и биназы (Ві). Исходя из поставленной цели были сформулированы следующие задачи: а) получение генов гибридных РНКаз на основе генов Ва и Ві; б) разработка высокоэффективной системы экспрессии РНКаз Ва, Ві и гибридных РНКаз, и их очистка; в) изучение каталитических свойств и термостабильногги биназы, барназы и гибридных РНКаз; г) разработка системы экспрессии и лабораторного метода очистки природного ингибитора барстара.
Научная новизна и практическая ценность работы. Разработан оригинальный метод рекомбинации гомологов. Этот метод применен для создания набора гибридных
2 генов на основе генов РНКазы Bacillus amylohquefaciens (Ва) и Bacillus intermedins 7Р (Bi). Разработана стабильная система экспресии гибридных РНКаз, биназы, барназы и природного ингибитора барназы - барстара, основанная на использовании промотора РНК-полимеразы фага Т7. Разработаны оригинальные схемы очистки бактериальных РНКаз и ингибитора - барстара при выделении из штаммов E.coli. Уточнены физико-химические свойства рекомбинантной биназы. Проведено сравнительное изучение каталитических свойств и термостабильиости гибридных РНКаз, биназы и барназы. Впервые экспериментально показано, что С-концевая последовательность РНКазы определяет каталитические параметры фермента при расщеплении динуклеозидмонофосфатов.
Апробация работы. Материалы исследований по теме диссертации доложены на следующих российских и международных конференциях: 3-ем Международном симпоузиме "Рибонуклеазы: химия, биология и биотехнология" (Италия, 1993г.), VI-ой Конференции Российской Федерации "Новые направления биотехнологии" (Пущино, 1994г.), Международном симпозиуме по биотехнологии (США, 1995г.), Международной конференции памяти акад. А.А. Баева (Москва, 1996г.) и 4-ом Международном симпозиуме "Рибонуклеазы: химия, биология, биотехнология" (Нидерланды, 1996г.)
Публикации. По материалам диссертации опубликовано семь печатных работ.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на страницах
машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части,
результатов и обсуждения, выводов и списка цитированной литературы. Работа содержит
таблиц и рисунков.