Введение к работе
Актуальность темы. Отличительной особенностью бактерий рода Pseudomonas является способность продуцировать широкий спектр веществ, называемых "вторичными метаболитами", среди которых присутствуют антибиотически активные соединения (Budzikiewicz, 1993). К числу последних относятся феназиновые пигменты азотсодержащие гетероциклические соединения с широким спектром антибиотического действия по отношению к бактериям и грибам. Способность некоторых бактерий синтезировать феназиновые пигменты известна микробиологам давно и использовалась в традиционной систематике микроорганизмов как важный таксономический признак (Balow et al., 1992). В ранних работах было показано, что феназины представляют собой побочные продукты биосинтеза шикимовой кислоты, однако детали отдельных реакций, а также генетический контроль процесса их биосинтеза до недавнего времени оставались неисследованными (Leisingei, Margraff, 1979). Существует несколько моделей для обьяснения антибиотического действия феназинов, включая ингибирование репликации ДНК, нарушение функционирования электронтраиспортной цепи и мембранного транспорта (Бриттон, 1986).
Целый ряд данных свидетельствует о том, что соединения феназинового ряда оказывают существенное влияние прежде всего на конкурентноспособность бактерий-продуцентов в окружающей среде (Mazzola et al., 1992). Показано, что комплекс феназиновых пигментов, продуцируемых ризосферными псевдомонадами, ингибирует развитие фнтопатогенных грибов. Поэтому в последнее время предпринимается все больше попыток использовать такие штаммы в биоконтроле заболеваний сельскохозяйственных культур (Cook et al., 1995).
Таким образом, изучение пути биосинтеза феназинов и генетического контроля этого процесса представляет несомненный интерес с точки зрения выяснения молекулярных механизмов регуляции ' н эволюционирования подобных генетических систем у микроорганизмов. С практической точки зрения эти исследования обеспечивают возможность селекции природных штаммов и создания трансгенных ризосферных бактерий для осуществления биологического контроля и борьбы с целым рядом заболеваний растений.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось проведение подробного структурно-функционального анализа генетического локуса, контролирующего биосинтез феназин-1 -карбоновой кислоты у Pseudomonas jluorescens 2-79.
4 Исходя из этого, в работе последовательно ставились следующие конкретные задачи:
1) Картировать область генома штамма P. fluorescein 2-79, содержащую генетический
локус биосинтеза феназин-1-карболовой кислоты.
-
Определить нуклеотидную последовательность генов биосинтеза феназин-1-карбоновой кислоты.
-
Изучить роль отдельных структурных генов в продукции феназин-1-карбоновой кислоты и ее интермедиатов.
-
Подобрать высокоспецифичные зонды для обнаружения природных и трансгенных бактерий-продуцентов феназинов.
Новизна результатов. Полученные в ходе данной работы результаты носят приоритетный характер. Впервые определена нуклеотидная последовательность генов phz, контролирующих биосинтез феназин-1-карбоновой кислоты у P. fluorescens. Анализ секвенированного фрагмента ДНК выявил ряд интересных особенностей организации оперона структурных генов, в частности высокую гомологию генов phzA и phzB. На основании анализа продукции феназин-1-карбоновой кислоты в клетках Е. coli, содержащих клонированные гены phz, а также в мутантных штаммах P. fluorescens, предложена схема пути биосинтеза антибиотика. Показано, что гены, контролирующие биосинтез феназинов у различных видов псевдомонад, гомологичны друг другу.
Практическое значение работы. Несмотря на то, что настоящая работа относится к числу фундаментальных исследований, данные, полученные в ходе этой работы, могуг найти применение как при селекции более эффективных природных штаммов-продуцентов для последующего их использования в биоконтроле, так и при создании трансгенных бактерий с заданными свойствами. Необходимо подчеркнуть, что широкомасштабное применение трансгенных штаммов бактерий связано прежде всего с проблемой точного прогнозирования и осуществления наблюдения за поведением генетически модифицированных микроорганизмов в окружающей среде. В ходе работы подобраны высокоспецифичные олигонуклеотидные праймеры и ДНК-зонды, позволяющие детектировать гены биосинтеза феназинов у природных бактериальных изолятов из ризосферы растений, а также у других видов псевдомонад. Это дает возможность быстро и эффективно идентифицировать штаммы-продуценты феназинов с помощью таких чувствительных методов как ПЦР и ДНК-ДНК-гибридизация в ходе
5 изучения продукции феназиновых антибиотиков в почве и популяционной динамики соответствующих микроорганизмов в ризосфере растений.
Апробация работы. Материалы диссертации представлены на международных конференциях "Pseudomonas 1995" (Tsukuba, Japan. 1995 г.) и "Molecular Genetics of Bacteria and Phages" (Cold Spring Harbor, USA, 1996 г.), а также ежегодной сессии Ученого Совета ИБФМ РАН, посвященному подведению итогов конкурса научных работ (Пущино, 1994 г.).
Публикации. Основное содержание работы изложено в трех статьях.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследования, обсуждения, выводов, списка использованной литературы и приложения. Диссертация изложена на 119 страницах машинописного текста, содержит 20 рисунков и 4 таблицы. Список цитируемой литературы включает 138 источников.