Введение к работе
Актуальность темі. Индивидуальное развитие - это процесс, в ходе которого реализуется программа избирательной экспрессии генов при постоянном генофонде, в результате чего из одной оплодотворенной клетки формируется сложный организм. Важнейший аспект этого процесса - дифференцировка тканей, которая обеспечивает разнообразие и единство взрослого организма.' Даже в отдельной дифференцированной клетке определенная информация может найти выражение в какой-то период времени, оставаясь невыраженной в другой. Шражение ее может меняться при индукции самыми различными стимуляторами - гормонами, митогенами, катаболитами и т.д. Во всех случаях переключение генетической программы клетки вызывает сложные изменения в ее метаболизме. Тонко отлаженные регу-ляторные механизмы активируют и инактивируют соответствую?^ участки генома в соответствии с изменением потребностей клетки. Как регулируется активность генов? Существует ли какой-то общий механизм такой регуляции у разных организмов? Как устроены и функционируют эукариотичсссие гены (Korochkin, 1931Г Нейфах, Тимофеева, 1978; Рэфф, Кофмен, 1986)?
Актуальность поставленных задач очевидна, ибо их решение прольет свет на такие фундаментальные проблемы, как эмбриональное развитие, дифференцировка, злокачественный рост, действие гормонов, нарушение метаболизма, врожденные дефекты и многие другие.
Бурное развитие методов генной инженерии за последние годы значительно расширило круг подходов к исследованию этих проблем. Сейчас клонировано большое число индивидуальных эукариоигческих генов, интенсивно изучаются их структурные и функциональные особенности.- Такие исследования привели к открытию новых принципов регуляции экспрессии генов, общих черт строения генома эукариот, различных регуляторних элементов генов, что позволило подойти к выявлению факторов диффоренцировки и временной активности генов (Корочкші, 1901; Корочкин, 1983).
Исследование взаимодействия генов в процессе формирования какого-то признака удобнее проводить на модельной системе со строго оргапоспецифическим синтезом какого-либо фермента, появляющегося на определеішой стадии развития. Такая модель позволяет детальнее проанализировать этапы формирования данного призна-
ка от активации структурного гена до появления соответствующего фермента в фенотипе и учесть возможное .влияние других генов на его фенотипическую экспрессию.
В настоящей работе в качестве экспериментальной модельной системы мы использовали тканеспецифический синтез изоферыента эстеразы S у различных видов Droaophila группы virilia.
Цель работы. Целью данной работы является изучение структуры клонированного гена, его транскрипции, тканеспецифической экспрессии в ходе индивидуального развития и выяснение общих
черт В строении ГеНОВ ЭСТераз родственных ВИДОВ Droaophila.
Научная новизна результатов исследований. Проведена количественная характеристика транскрипции гена органоспецифической эстеразы S в различных органах и на разных стадиях развития D.viriiis, Показано, что семявыноспщие луковицы являются основным местом синтеза фермента у зрелых самцов D.viriiis. Воспользовавшись методом количественного з.-анализа, мы определили место инициации транскрипции гена Eat-S, обнаружив при этом две мажорных точки инициации синтеза РНК, разделенных пятью парами ну-клеотидов, а также целый ряд подобных точек минорного характера, располагающихся как выше, так и ниже основных.
В настоящей работе мы также определили первичную структуру 3- и 5-фланкирующих участков генат при помощи компьютерного анализа сравнивали эту область с различными участками контроля транскрипции - энхансерами, длинными концевыми повторами вирусов и мооильных генетических элементов.
Оказалось, что область за 100-300 нуклеотидов перед точкой "инициации транскрипции заполнена областями гомологии с различными энхансерами, а также ретровируеоподобными последовательностями типа мдг (мобильных диспергированных генов, представляющих нестабильный компонент генома).
При поиске последовательностей, гомологичных гену Eat-S У разных таксонов было обнаружено, что в геномах крысы, мыши и кролика присутствуют последовательности, гомологичные небольшой транскрибируемой области остеразного гена d.virilia. Было показано также, что в геномах указанных таксонов эти последовательности многократно повторяются, а в геноме крысы - активно транскрибируются во всех исследованных органах.
Исследование структуры гена органоспецифической эстеразы s D.viriiis в пределах группы virilia выявили высокий консерва-
тизм гена в пределах гэтих видов и его дивергенцию у далеких видов, что позволяет сделать вывод о возможности использования гена Est-s дал уточнения филогенетических отношений между близкими и отдаленными видами организмов.
Исследование полиморфизма локуса Est-S 20-ти линий D.viri-lia выявило высокую генетическую стабильность локуса и прилежащей области как в отношении точечных замен, затрагивающих рест-рикционные сайты, так и в отношении крупных изменений типа делений или инсерцип. Лишь в одной линии обнаружена инсерция фрагмента ДЖ длиной 3,4 т.п.н. Природа обнаруженной инсерции в линии 140а пока не выяснена.
Практическая ценность. Полученные в данной работе материалы используются в преподавании в МГУ, а предложенные модификации методов могут быть рекомендованії з различных лабораториях страны в области генетики развития.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на Международном симпозиуме "Организация и экспрессия тканеспецифических генов" (Новосибирск, 1982), на УІІІ Всесоюзном симпозиуме "Структура и функция клеточного ядра" (Пущине-, 1984), на ХУІ конференции Федерации Европейских Биохимических Обществ (Москва, Г984), на Совместном симпозиуме СССР-ФРГ "Структура и функция генома" (Ленинград, 1905), на Совместном симпозиуме СССР-ГДР (Рига, 1985), на УІІІ Совместном симпозиуме СССР-ФРГ "Организация генома и регуляция активности генов" (Иркутск, 1989), на УІ Международном конгрессе по изоферментам (Тояма, Япония, 1989).
Публикации. По темо диссертации опубликовано 19 научных работ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из общей характеристики работы (введение), обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения и обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на 142 страницах машинописного текста и включает 24 рисунка. Библиографический указатель содержит 259 ссылок на работы отечественных и зарубежных авторов.