Введение к работе
Актуальность проблемы. Одной из фундаментальных задач современной фитовирусологии является установление структуры вирусных геномов. Результаты, полученные в последнее десятилетие сделали возможным более глубокое изучение и поникание стратегии экспрессии вирусного генома, механизмов репликации, молекулярной основы процессов взаимодействия вирусов с растением-хезяинем и переносчиками вирусной инфекции. Структура генома, характерная для каждой систематической группы вирусов, является одним из наиболее объективных критериев при построении филогенетических линий вирусов и их систематики.
В то же время, совершенно очевидно, что работы, направленные на изучение структуры и экспрессии геномов фитовирусов имеют не только фундаментальное значение, но и определяют новые подходы к прикладным проблемам вирусологии являясь основой для разработки новых, высокоэффективных методов диагностики и борьбы с вирусной инфекцией.
Одной из интересных, как в фундаментальном, так и в практическом плане групп растительных вирусов, является недавно выделенная группа диантовирусов, представители которой поражают ряд важных сельскохозяйственных и декоративных растений. В настоящее время четко идентифицировано только трут диантовируей:-вирус кольцевой пятнистости гвоздики (ВКПГ), вирус некротической мозаики красного клевера (ВНМКК) и вирус некротической мозаики сладкого клевера (ВНМСК). В отличие ОТ ВНМКК и ВНМСК, структура и механизм экспрессии гечома которых достаточно хорошо исследованы, ВКПГ остается наименее изученным с этой точки зрения представителем данной группы.
Темой настоящей диссертационной работы явилось исследование структуры геномной РНК-1 ВКПГ, получение и исследование серологических свойств рекомбинантного белка оболочки (БО) ВКПГ и близких ему по структуре рекомбинантных БО икосаэдрических вирусов: -кармовируса ыорщинчатости турнепса (ВМТ) и лютеовируса скручивания листьев картофеля (ВСЛК).
Цель и задачи исследования.
Основной целью работы было определение полной нуклеотидной последовательности геномной РНК-1 'ВКПГ.. В ходе исследования
решались следующие специфические задачи: получение банка кл нов, содержащих кДНК копии фрагментов геномной РНК-1 ВКП определение первичной структуры клонированных фрагментов кДН анализ нуклеотидной последовательности РНК-1 8КПГ, сравиител ное. изучение кодируемых РНК-1 ВКПГ белков, анализ возможн механизмов экспрессии белков, кодируемых РНК-1 ВКПГ.
Целью второго этапа работы являлось-,, получение рекомб нантных БО ВКПГ, ВМТ и БСЛК. На этом этапе "решались следуют задачи: клонирование генов БО ВКПГ, ВМТ и ВСЛК, экспресс полноразмерных и (или) делегированных фори БО указанных вирус в Е.соН, исследование серологических свойств экспрессированн рекомбинантных ЕО ВКПГ, ВМТ и ВСЛК с помощью антисыворот полученных к интактным вирионам.
Научная новизна работы.
В настоящей работе впервые определена полная нуклеотидн последовательность геномной РНК-1 ВКПГ. Установлено, что ген ВКПГ содержит основные элементы, характерные для диантовирусо Представлены данные о гомологии белков, кодируемых РНК-1 ВКПГ соответствующими белками, кодируемыми кармо-, томбуе, некро-лютеовирусами. Проанализированы возможные механизмы экспресс генов, локализованных в РНК-1 ВКПГ. Впервые получены рекомб нантные белки оболочек ВКПГ, ВМТ, ВСЛК и (или) их делетирова ные формы. Показано,что серологическое родство этих белков нативными вирионами в значительной степени детерминирует конформацией S-домена БО.
Практическая ценность работы.
Данные о нуклеотидной последовательности РНК-1 ВКПГ мог быть использованы для создания основанных на методе ПЦР и мог кулярной гибридизации систем тестирования диантовирусс Антисыварогки, к полученным рекомбинантным БО ВМТ и ВКПГ мол использовать для иммуноферментного тестирования инфицировав растений.
Апробация работы.-
Материалы диссертации докладывались на семинарах лабо[ тории молекулярной вирусологии ВНИИ СБ и международной КОН(] ренции памяти А. Н. Белозерского (Москва, МГУ, 1995).
убликации.
По материалам диссертации опубликовано 2 печатные работы, уклеотидная последовательность.РНК-1 ВКПГ представлена в базе анных EMBL/GenBank под номером L18870.
груктура и объем работы.
Диссертационная работа состоит из введения, глав "Обзор -ітературьі", "Материалы и методы", "Результаты и обсуждение", іключения, выводов и списка использованной литературы. Работа зложена на 133 машинописных страницах, включая 2 таблицы и 20 ісунков.