Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящее время все большее признание получают представления о реализации метаболических процессов на уровне структурно организованных полиферментных систем, сформированных из ферментов, осуществляющих последовательные метаболические реакции. Вместе с тем, механизмы регуляции подобных, а также других, находящихся на более высоком уровне структурированности систем, базируются на каталитических и регуляторних механизмах олкгомерных ферментов, занимающих наиболее низкий уровень в таких иерархически построении структурах. Значительная часть ферментов, участвующих в метаболизме, представляет собой олигомеры, состоящие из идентичных по химической структуре субъединиц. Уникальными особенностями подобных ферментов являются кооперативность функционирования и аллостерическая регулируемость, обеспечивающие их исключительную чувствительность к незначительным изменениям концентраций метаболитов в клетке.
Широко развернувшиеся в последнее время энзимологические исследования, с использованием наряду с растворимыми иммобилизованных форм ферментов, привели к значительному углублению наших представлений о молекулярном строении и механизмах функционирования ряда олигомерных ферментов, в большинстве своем представляющих димеры или тетрамеры. Вместе с тем, в связи с недостаточностью экспериментальных данных, относящихся в частности к молекулам с высокой степенью олигомерности, выяснение общих принципов формирования, функционирования и аллостерической регуляции кооперативных систем с взаимодействующими активными и регуляторними центрами остается нерешенной проблемой.
К числу ферментов, занимающих важное место в клеточном метаболизме, относится глутаматдегидрогеназа (ь-глутамат-НАБ(р)-оксидоредуктаза К.Ф. 1.4.1.3), катализирующая взаимопревращения L-глутаминовой и 2-оксоглутаровой, а также ряда других амино- и кетокислот. Согласно современным представлениям глутаматдегидрогеназа является связующим звеном ряда метаболических превращений, в частности реакций аминокислотного, углеводного и азотистого обменов. Участие глутаматдегидрогеназы в таком широком спектре
- 4 -метаболических процессов предполагает наличие у молекулы фермента различных механизмов оперативной регуляции каталитической активности, что, по-видимому, обеспечивается его гексамерным строением.
Очевидно, что значение исследований структурно-функциональных особенностей каталитически активного гексамера глутаматдегидрогеназы выходит за рамки выяснения принципов формирования и функционирования олигомерных систем, состоящих из идентичных субъединиц, и наряду с этим представляют интерес для понимания чрезвычайно важных вопросов контроля и регуляции метаболических процессов, в которых принимает участие этот фермент.
Цель и задачи исследования. Цель настоящего исследования заключалась в выяснении структурной организации и основных принципов кооперативного функционирования и аллостерической регуляции гексамера глутаматдегидрогеназы. Для достижения поставленных целей, в работе был использован комплексный подход, основанный, с одной стороны, на исследовании кооперативных и регуляторних характеристик различных растворимых производных глутаматдегидрогеназы, полученных путем специфической модификации функциональных групп фермента, и, с другой, - на изучении структурно-функциональных особенностей различных олигомерных форм фермента, полученных путем его иммобилизации на нерастворимом носителе.
Задачи настоящего исследования состояли в
получении методом химической модификации глутаматдегидрогеназы пиридоксаль-F* и ТМ0Р0звепроизводных фермента, с нарушениями з определенных звеньях системы взаимодействий между активными и регуляторними центрами, и исследовании их физико-химических, каталитических и регуляторних свойств;
разработке различных теоретических моделей кооперативной инактивации гексамера и его десенсибилизации к действию аллостери-ческого эффектора;
исследовании связи между структурной организацией гексамера глутаматдегидрогеназы и его кооперативными и аллостерическими
-пиридоксаль-о^фосфат
s-2,2,6,6-тетраметил-4-оксопиперидин-1-оксил.
характеристиками путем анализа экспериментальных данных в рамках разработанных моделей;
исследовании роли межсубъединичных контактов в обеспечении конформационной устойчивости глутаматдегидрогеназы;
иммобилизации гексамера на сефарозе посредством ковалентной сшивки одной из субъединиц, и исследовании процессов диссоциации и инактивации иммобилизованного фермента, с целью выяснения условий получения конформационно устойчивых олигомерных фрагментов гексамера и исследования их свойств;
выяснении взаимной ориентации субъединиц в составе гексамера глутаматдегидрогеназы и роли различных типов межсубъединичных контактов в формировании активных центров;
исследовании роли межсубъединичных взаимодействий в реализации механизмов кооперативного и аллостерического поведения гексамера.
Научная новизна и практическая ценность -работы. Комплексное изучение физико-химических, каталитических и регуляторних характеристик различных растворимых и иммобилизованных производных глутаматдегидрогеназы, моделирующих нативный фермент, позволило установить, что субъединицы, составляицие каталитически активный гексамер, занимают эквивалентные позиции и упакованы в структуру, описываемую точечной группой симметрии 3 21, с учетом внутренней асимметрии субъединиц. При этом каждая из субъединиц взаимодействует с соседними посредством двух типов контактов -идентичных изологических и идентичных гетерологических.
В рамках постулированной структурной организации гексамер может быть представлен как в виде структуры, сформированной из трех эквивалентных димеров (Зсх^), в которых субъединицы взаимодействуют посредством изологических контактов, так и з виде структуры, сформированной из двух эквивалентных тримеров (20^), в которых субъединицы взаимодействуют посредством гетерологических контактов.
Гексамер с постулированной структурной организацией представляет собой молекулу, обладающую минимальной степенью олиго-
х- здесь, и далее в тексте симметрия молекулы дана в символах Германа-Могена.
мерности, в которой эквивалентно ориентированные субьединицы участвуют в формировании двух простейших олигомерных фрагментов - димеров, с субъединицами, взаимодействующими посредством изо-логических контактов, и тримеров, имеющих кольцевую структуру с идентичными гетерологическими контактами.
Оба типа межсубъединичных контактов необходимы для обеспечения конформационной устойчивости каталитически активного гек-самера глутаматдегидрогеназы. Вместе с тем, ассоциация субъединиц в гексамеры не является необходимым условием сборки активных центров. При условии обеспечения конформационной устойчивости, для формирования активны:-; центров достаточно ассоциации субъединиц в кольцевые тримерные фрагменты посредством идентичных гетерологических контактов.
Как изологические, так и гетерологические межсубъединичные контакты принимают участие в формировании гексамера в виде система с взаимодействующими активными центрами.
Изологические контакты обеспечивают реципрокальные межсубъединичные взаимодействия, обусловливающие отрицательную коопера-тивность гексамера глутаматдегидрогеназы. Гетерологические межсубъединичные контакты обеспечивают взаимодействия между активными центрами, обусловливающие кооперативное действие аллостери-ческого эффектора gtp.
Полученные в настоящей работе данные о структурной организации гексамера и о роли различных межсубъединичных контактов в его реализации в виде системы с взаимодействующими активными центрами, удовлетворяют требованиям, предъявляемым к олигомер-ным ферментам, функционирующим по кооперативному механизму "flip-flop". При этом, подобный кооперативный механизм может быть реализован как в рамках каждого из трех димерных фрагментов об), так и в рамках гексамера в целом, при его представлении в виде димера идентичных тримеров - 2 оСо.
Вместе с тем, полученные данные не исключают возможность функционирования глутаматдегидрогеназы в виде планарного тримера oi'g, при условии обеспечения его конформационной устойчивости, которая может быть реализована, в частности,при включении глутаматдегидрогеназы в состав структурно организованных полиферментных систем.
Результаты настоящей работы могут быть использованы при выявлении общих закономерностей кооперативного функционирования и аллостерической регуляции олигомерных ферментов, сформированных из идентичных субъединиц. Предложенные методы теоретического анализа различных моделей кооперативной инактивации и аллостерической регуляции гексамера глутаматдегидрогеназы могут найти применение при исследовании других олигомерных ферментов.
Полученные в результате проведенных исследований сведения о механизме кооперативного функционирования и аллостерической регуляции глутаматдегидрогеназы открывают возможности целенаправленного поиска путей контролируемых воздействий на метаболические процессы, в которых принимает участие глутаматдегидроге-наза. Кроме того, полученные результаты могут найти применение для усовершенствования промышленных методов энзиматического получения оптических изомеров ь-аминокислот из соответствующих кетокислот.
Апробация работы. Материалы диссертации были доложены и обсуждены на:
Ш Всесоюзном симпозиуме "Структура и функции активных центров ферментов", (Пущино на Оке, 1976),
Международном симпозиуме по аминокислотам, пептидам и белкам, (Ереван, 1978),
IV Всесоюзном симпозиуме "Физико-химические основы ферментатив
ного катализа и его регуляция", (Москва, 1982),
Конференции по молекулярно-клеточной биологии, (Ереван, 1983),
Шестой Закавказской конференции по адсорбции и хроматографии,
(Ереван, 1984),
16-ой конференции ФЕЮ, (Москва, 1984),
Симпозиуме "Макромолекулы и функционирование клетки", (Ереван,
1986),
V Всесоюзной научной конференции "Проблемы и перспективы фер
ментативного катализа", (Москва, 1987),
IX симпозиуме биохимических обществ ГДР и СССР "Метаболическая регуляция на клеточном и молекулярном уровне", (йена, ГДР, 1987).
Работа апробирована на совместном научном коллоквиуме лабораторий стереохимии ферментативных реакций и химии регуляторов
ферментативной активности ИМБ АН СССР от 10 октября 1989г.
Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы (гл.1), описания методов исследований (гл.2), результатов экспериментов и их обсуждения (гл. 3-6), заключения, выводов, приложений I и II и списка цитируемой литературы.