Введение к работе
Актуадьность задачи.Бурное развитие методов молекулярного клонирования и секвенирования ДНК сделало возможным исследование протяженных участков генома и генов, в том числе тех, которые обеспечивают основные клеточные функции. Среди них наиболее изученными являются гены рибосомных РНК. Оки относятся к повторяющимся генам, присутствуют у человека в количестве около 400 копий и формируют 10 ядршковьк организаторов (ЯОР), расположенных на 5 парах акроцентрических хромосом.
Тот факт, что большие количества рибосомксп РНК необходимы -практически во всех клетках организма, делает актуальным изучение механизмов транскрипции рибосомных генов и выявление особенностей организации тех участков рДНК, которые отвечают за регуляцию этого процесса. Известно, что эффективность экспрессии генов рРНК у эукзриот определяется, помимо промотора, взаимодействием ряда цис- и транс-факторов в предпромоторной области. Организация этих регуляторних участков носит вндоспецифичный характер в отличие от универсального характера организации транскрибируемой области. Из пяти типов контрольных элементов, присутствующих в предпромоторной области нетранскрнбнруемого спейсерз крысы, у человека определена локализация только двух, несмотря на то, что первичная структура генов рРНК человека к настоящему времени полностью установлена.Общепринятая концепция согласованной эволюции генов рибосомной РНК не дает ответа на вопрос о том, как в этой части генома могут закрепляться эволюционные изменения и что является ведущим фактором в этом процессе.Остаётся нерешенным еоп-рос о локализации точек начала и конца репликации в кластерах рДНК; данные на эту тему носят противоречивый характер.Известно, что отдельные области рДНК, будучи включены в другие районы генома, повышают в них частоту рекомбинации. Следует отметить тот факт, что данные цитологических, молекулярных и функциональных исследований ЯОР-обрагующих участков генома в большинстве случаев носят разобщённый характер и друг с другом не сопоставляются. Б этой связи, необходимы дальнейшие исследования структурно-функциональной организации к полиморфизма гєнсе рРНК.
Цель и задачи исследования.Настоящая работа посвящена характеристике индивидуальных повторяющихся единиц рДНК iS-сй хро-
мссомы человека, клонированных в космидные вектора, в составе двух независимо полученных библиотек. Это позволило охарактеризовать внутри- и межгеномный полиморфизм отдельных мономеров. Основной упор в нашем исследовании делался на изучении полиморфизма, определяемого кластерными повторами в рДНК, а также на. поиск и характеристику других участков рДНК с повышенной нестабильностью. Б работе были поставлены следующие задачи:
-
отбор космид, содержащих рДНК, из космидных библиотек 13-й хромосомы человека;
-
анализ отобранных космид с помощью рестрикции и гибридизации по Сзузеряу, используя набор олнгонуклеотидных зондов, специфичных к консервативным и вариабельны),! участкам рДНК;
-
секвенирование концов космидных вставок и их локализация на карте рДНК;
-
определение нуклеогидных последовательностей некоторых дефектных рДНК-кланов.
Научная новизна и практическое значение работы. Разработан рестрикционнс-гибридизационный подход, позволяющий выявлять структурные различия мелщу клонированными повторами единиц рДНК. Обнаружен внугригеновдый полиморфизм рДНК, проявляющийся в разном содержании и распределении гипервариабельных мини- и микросателлитов и в различиях по сайтам рестрикции у мономеров рДНК 13-ой хромосомы человека. Обнаружены районы повышенной нестабильности рДНК. Показана гиперчувсгвитедьность SauSA-сайтов в области, предшествующей началу репликации рДНК. Обнаружены случаи делений в клонах рДНК по местам скопления микросателлитных кластеров. Определен полиморфизм предпромоторной области гєное рРНК человека.
Полученные данные могут быть использованы для анализа геномного полиморфизма человека з медико-генетических, популяцион-кых и экологических исследованиях.
Апробация результатов. Результаты настоящей работы были представлены на 3-ей международней конференции по ДНК-фингерприн-тингу (Индия, 1994), 5-ой конференции "Геном человека" (Россия, 199Є), международной конференции по биотехнологии (Турция, 1996), международной конференция "Геном человека" (ФРГ, 1996.) и межлабораторнсм семинаре в Институте биологии гена (1997).
Публикации. По материалы диссертации опубликовано 9 научных работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на І06 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, результатов и их обсуждения, заключения, еыеодое и списка цитируемой литературы. Работа иллюстрирована 11 рисунками.