Введение к работе
.1 Актуальность проблемы
Проблема реализации генетической информации является одной из сновшх в молекулярной биологии. Экспрессия гена осуществляется осредством транскрипции и трансляции. При трансляции одной из сновных стадий, определяющих эффективность перевода генетической нформации от МРНК к белку, является стадия инициация. До недавнего ремени господствовала точка зрения, что инициация трансляции у сех эукариотических мРНК идет по одному механизму: взаимодействие 'яда эукариотических факторов инициации трансляции с кэп-струкгурой [РНК опосредует присоединение 40s рибосомальной субъедишщы :епосредетвенно к 5'-концевому сегменту РНК. После этого :убъединица непрерывно движется в 3'-направлении ("сканирует") ідоль 5'-нетранслируемой области (5-НТО) РНК до первого нициаторного кодона (aug в контексте рцруруАШРи, где подчеркнуты іаиболее важные позиции, влияющие на эффективность инициации трансляции на данном aug). Затем происходит сборка рибосомы и гачинается синтез белка.
Определение первичной структуры многих эукариотических генов зыявило новый класс эукариотических мРНК (около 10% от общего іисла), либо не имеющих кэп-структуры либо обладающих протяженной (от 300 до 2000 нуклеотидов) 5-НТО с многочисленными игощиаторными содонами в ней. При этом синтез белка начинается лишь с удаленного стартового кодона, игнорируя все предыдущие дао триплеты. Наличие тодобных мРНК противоречило общепринятому механизму инициации грансляции. Было выдвинуто предположение о существовании для некоторых мРНК данного класса альтернативного кэп-независимого механизма внутренней инициации трансляции (БИТ), заключающегося в присоединении 40s рибосомальной субьединицд (либо рибосомы) к внутреннему сегменту 5-НТ0 мРНК. Такая посадка, вероятно, опосредована многоточечным взаимодействием рибосомы с некими цис-элементами матрицы. Поэтому, выявление структурных и функциональных особенностей организации подобных цис-элементов способствовало бы пониманию нового механизма инициации трансляции. Помимо фундаментального значения в понимании механизмов реализации генетической информации и ее регуляции, подобные исследования представляют и чисто практический интерес, поскольку многие вирусные геномы, онкогены, гены, определяющие тканевую дифференцировку и т.д. кодируют мРНК с предполагаемой БИТ.
Перспективным объектом в изучении механизма ВИТ является семейство пикорнавирусов, вызывающих многие заболевания человека и животных, проявляющиеся в виде энцефалитов, менингитов, миокардитов, гепатитов, обычных простуд и т.д.. Геном пикорнавирусов представляет из себя одноцепочечную РНК положительной полярности, длиной 7500-8000 нуклеотидов, которая является матрицей для синтеза всех вирус-специфических белков, кодируемых в единой открытой рагике считывания. Пикорнавирусная РЕК имеет протяженную 5-НТО (от 600 до 1100 нт) с многочисленными AUG триплетами. Правильность выбора объекта была подтвервдена впоследствии - именно на примере пикорнавирусов впервые было доказано существование неканонического механизма иш. ии^едєлениб структурных и функциональных особенностей центральной части 5-НТО РНК пикорнавирусов значительно способствовало бы детальному изучению механизма ВИТ и, обусловленной ею, эффективности репродукции вирусов в различных системах.
Изучение структурных особенностей концевых фрагментов НТО РНК (как 5'-, так и 3'-) пикорнавирусов также предсталяет большой научный и практический интерес, поскольку эти участки РНК вовлечены в процесс репликации вирусного генома. Знание пространственной организации этих цис-элементов позволит целенаправленно планировать исследования механизма репликации.
На основе фундаментальных знаний о строении и функциональной значимости отдельных элементов НТО РНК пикорнавирусов открываются перспективы в разработке новых эффективных вакцин и других противовирусных препаратов.
1.2 Цель и задачи исследования
Основная цель работы состояла в определении вторичных структур НТО РНК пикорнавирусов, выявлении потенциальных третичных взаимодействий, анализе общих и специфических особенностей организации НТО РНК у различных представителей пикорнавирусов и в выявлении функционально важных трансляционных цис-элементоз 5-НТО РНК пикорнавирусов посредством создания новых рекомбинантных геномов и их детального изучения in vitro и in vivo. При этом были поставлены и решались следующие задачи:
-
Построение на основе филогенетического анализа консенсусних (для больших групп представителей пикорнавирусов) моделей вторичных структур функционально зажных сегментов НТО.
-
Экспериментальное подтверждение построенных моделей укладки
РНК на примере ряда представителей каждой структурной группы.
3. Выявление локальных различий в организации НТО внутри
каждой группы вирусов, имеющих общие элементы вторичной структуры,
и анализ их возможного происхождения.
4. Поиск возможных консенсусних третичных взаимодействий в НТО
РНК пикорнавирусов.
-
Создание рекомбинантных геномов у представителей групп пикорнавирусов, имеющих различную структурную организацию 5-НТО РНК. Их детальное изучение с целью выявления функционально важных цис-элементов, вовлеченных в процесс ВИТ.
-
Выявление общих закономерностей выбора места посадки рибосомы на внутренний сегмент РНК в процессе ВИТ.
1.3 Научная новизна и практическая ценность работы
На основе сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей РНК около тридцати представителей семейства пикорнавирусов были построены два типа консервативных вторичных структур для сегментов 5-НТО РНК (длиной около 500 нуклеотидов), обеспечивающих ВИТ у пикорнавирусов. Эти сегменты получили навание "'внутренний сегмент присоединения рибосомы", (ires). Было показано, что из четырех родов семейства пикорнавирусов, энтеро-(дредставигели - вирусы полиомиелита, коксакивирусы) и ркнсвирусы (возбудители острых респираторных заболеваний) - Э?-группа - имеют один тип укладки iRES'a; в то время как кардио- (представители -вирус энцефаломиокардитз мышей, вирус энцефаломиелита мышей Тейлера) и афтовирусы (вирусы ящура) - КА-группа - имеет другой. ires'h ЭР- и КА-групп не имеют никакого сходства на уровне первичной и вторичной структур РНК, и, следовательно, одна и та же функция - присоединение рибосомы к внутреннему участку РНК - может обеспечиваться различными цис-элементами РНК. Предложенные модели вторичных структур РНК были экспериментально подтверждены методами ферментативного и химического зондирования одно- к двуцепочечных участков РНК. на примере ряда представителей ЭР- и КА-групп. На основе структурных данных было предложено объяснение зттенуирующих мутаций в 5-НТО РНК полиовируса типов I и 3 с точки зрения ослабления консервативных элементов вторичной структуры. Это предположение было впоследствие подтверждено как нашшл анализом реверсий в природных изолятах вируса полиомиелита, так и при целенаправленном ослаблении структурных элементов ires'а в работах других авторов.
С помощью филогенетического анализа РНК представителей
ЭР-групш были выявлены потенциальные участки третичных
взаимодействий, в случае реализации которых ires приобретал бы
двухдольную пространственную конфигурацию. Предложенные
взаимодействия консервируются у всей ЭР-группы и хорошо согласуются с имеющимися экспериментальными данными по зондированию РНК, Интересно, что аттенуирукщие мутации полиовируса типа 2 локализованы внутри одного из районов потенциальных третичных взаимодействий и приводят к уменьшению его термодинамической стабильности, что, возможно, влияет на эффективность трансляции его РНК (особенно, в нервной ткани).
На основе анализа первичной структуры РНК были построены и экспериментально подтверждены вторичные структуры 3-КТО РНК у энтеро- и риновирусов. У знтеровирусов найдено консервативное третичное взаимодействие (аналогичное связи между d и т петлями тРНК), способное образовать каркас Г-обрэзной пространственной конфигурации терминального сегмента РНК. В 5'-концевом, "репликативном" сегменте 5-НТО РНК ЭР-групш, имеющем консервативную "клеверообразную" вторичную структуру, было найдено аналогичное третичное взаимодействие. Выдвинута гипотеза о сходной, тРНК-подобной пространственной организации 5'- и 3'- цис-сегментов КТО ЭР-группы, вовлеченных в процесс репликации генома пикорнавирусов.
Наряду со сходством в строении ires'ob и "репликзтявяых" сегментов геномов разных пикорнавирусов были обнаружены некоторые межродовые и внутриродовые различия в организации их НТО. Рыла выдвинута и обоснована гипотеза об эволюции НТО РНК пикорнавирусов посредством дупликаций ее отдельных участков и целых доменов. Полученные данные можно использовать в эволюционных гостроениях.
Существенно различаясь по нуклеотидной последовательности и имея различные типы укладки ihes'ob, геномы всех пикорнавирусов имеют схожий элемент в 3'-концевом фрагменте 5-НТО. Этот элемент состоит из олигопиримидина и - на расстоянии 20-24 нуклеотвдов от него - aug триплета ("молчащего" для ЭР-группы и ишщиаторного для КА-грушш). Было выдвинуто . предположение о значимости этого элемента для ВИТ- и связанных с ней инфекционности и репродуктивной способности пикорнавирусов.
Для проверіси данной гипотезы на основе полиовируса типа I, штамм маїюпеу (представителя ЭР-групш ,\ было создано более 20
рекомбинантных геномов с делениями, вставками и точечными нуклеотиднкми заменами в области тандема олигоігиртедик/модчащий aug. Были- изучены матричные активности рекомбинантных РНК, инфекционность и бляшечный фенотип мутантов. От ряда мутантних вирусов с ухудшенной репродуктивной способностью было отобрано и изучено более 40 различных псевдоревертантов с частичным восстановлением функциональной активности. Была определена первичная структура РНК всех ревертантов в районе тандема олигопйримидин/AUG. На основе этих данных был охарактеризован новый трансляционный регуляторний цис-элемент РНК, определяющий эффективность ВИТ - тандем олигогшримидина (комплементарного 3'"-киицу Ids риоосомальной РНК) и aug (молчащего лиоо инициаторного) на определенном (15-30 нуклеотидов) расстоянии от него. Выдвинута гипотеза о сходстве ВИТ эукариотических мРНК с прокариотической инициацией трансляции. При этом, у эукариотических матриц имеются два существенных отличия: во-первых,. помимо тандема олигогшримидин/AUG, необходимо наличие примыкающего к нему протяженного цис-элемента (ires'а), и, во-вторых, aug выступает в роли сигнала, не обязательно означающего начало белкового синтеза (трансляция начинается только в том случае, когда aug имеет инициаторный контекст). Поскольку все представители ЭР~гругшы имеют одинаковую ' с полиовирусом структуру ires'а, вышеизложенные результаты были экстраполированы на всю группу, что в дальнейшем получило подтверждение в работах других авторов на отличных от полиовирусэ объектах.
Для изучения роли тандема олитсігиримидин/aug у КА-группы в качестве объекта был выбран вирус энцефаломиелита мышей Тендера (ВЭМТ), штаммы gdvii к вєап. Создано более 30 рекомбинантных геномов по стратегии, использовавшейся при изучении полиовирусэ. Изучены матричные активности мутантних РНК в двух бесклеточных Селок-синтезирующкх системах и их инфекционность, стабильность и
фЗНОТИП реКОМбИНЗНТНЫХ ЗИРУСОВ В КУЛЬТУре КЛеТОК ВІЇК-21. Было
показано, что в этих системах тандем олигопиримидин/AUG не играет существенной роли в поездке рибосомы на внутренний участок РНК ВЭМТа.
Поскольку тандем олигопиртшдин/инициаторхшй aug зволюционно консервируется у всей КА-группы, было выдвинуто предположение о его возможной значимости для эффективности ВИТ и, следовательно, для размножения вируса, в некоторых специализированных системах,
например, таких, как нервная ткань. Была изучена нейровирулентность около 20 различных рзкомбинантных вирусов вирулентного штамма gdvii ВЭМТ, имеющих различные мутации в РНК в области тандема олигопиримидин/AUG. Было изолировано более дюжины различных псевдоревертантов от ряда аттенуированшх мутантов, определена первичная структура .их РНК, для некоторых изолятов исследована вирулентность. В результате была доказана необходимость тандема олигопиримидин/AUG в геноме ВЭМТ для размножения в нервных клетках мышей. Таким образом, впервые была показана тканеспецифичность зтого трансляционного цис-элемента.
На основании совокупности данных была выдвинута и обоснована гипотеза о двоякой роли тандема слнгсіл:пдімидин/.Аис при посадке рибосомы на внутренний сегмент РНК в процессе ВИТ. Функциональная значимость тандема проявляется по разному, с одной стороны, в одной и той же трансляционной системе, если тандем примыкает к разным типам ires'ов (ЭР- либо КА-группы), а, с другой стороны, в различных трансляционных системах у одного и того же объекта.
На примере ВЗМТ было доказано, что при посадке рибосомы существует лишь один, жестко фиксированный в пространстве внутренний локус РНК, с которого рибосома способна начать движение вдоль РНК (будь то поиск aug или синтез белка). Для зтого участка РНК было обосновано и введено понятие стартового окна (СО) -отдельного функционального цис-элемента РКК, принимающего участие в ВИТ. Была разработана стратегия идентификации СО у матриц с ВИТ; для ВЭМТа были определены размер, локализация и особенности строения СО; показано взаимоотношение между ires'om и СО. Введенное понятие является универсальным для всех мРНК с ВИТ.
Предложена и обоснована общая для всех пикорнавирусов (а, возможно, для всех РЖ с ВИТ) модель посадки рибосомы на внутренний участок РНК.
Полученные данные по структурной организации нетранслируемых
областей пикорнавирусов широко используются при изучении роли
структурных элементов в инициации трансляции и репликации, при
выявлении РНК-белковых взаимодействий, лежащих в основе этих
механизмов, также как и при изучении агтенуации вирусов.
Обнаружение тканеспецифического элемента, играющего большую роль в
аттенуации вирусов, дает новый перспективный подход к созданию
вакцин для ряда вирусов, вызывающих опасные заболевания человека и
животных. '
1.4 Апробация работы
Материалы работы были доложены и обсуждены на и двустороннем советско-американском симпозиуме "Структура эукариотического генома и регуляция его экспрессии" (Тбилиси, 1989); Международных съездах, симпозиумах и конференциях: "Молекулярная организация биологических структур" (Москва, 1989), "Регуляция трансляции в вирус-инфицированных клетках животных" (Мадрид, 1991), "Биосинтез белков" (Пущино, 1991), "Трансляционный контроль" (Колд Спринт Харбор, 1992 и 1994), "Генетическая рекомбинация и дефектные интерферирующие частіша у РНК-содержащих вирусов" (Мадрид, 1994), "Молекулярная биология пикорнавирусов" (Корпилампи, Финляндия, 1994); на їх Международном Вирусологическом Конгрессе (Глазго, 1993), ш Всероссийской конференции по направлению "Генная и клеточная инженерия" (Пущино, 1993), а также на семинарах в МГУ, Кембриджском университете и Институте полиомиелита к вирусных энцефалитов РАМН.
1.5 Использованные сокращения
5- и 3-КГО - 5' и 3'-нетранслируемая область; ВИТ - внутренняя инициация трансляции; ires - внутренний сегмент присоединения рибосомы; СО - стартовое окно; ЭР (-группа) - группа энтеро- и риновирусов; КА (-группа) - группа кардио- и афтовирусов; ВЭМТ -вирус энцефаломиелита мышей Тендера; ВЭМК - вирус энцефаломиокардита мышей; ОРС - открытая рамка считывания; РЛК -ретикулоцитный лизат кроликов; нт - нуклеотид(ы); ТГЩго - 50?» тканевая цитопатогенная доза; ПДбо - 50% патогенная доза.