Введение к работе
Актуальность проблемы. Индукция сарком у цыплят фильтрующимся агентом описана П.Раусом в I9II г., и с тех пор вирус, названный его именем, наряду с множеством других ретровирусов, интенсивно исследуется как модель или участник различных биологических процессов, включая образование злокачественных опухолей, эмбриональное развитие, соматические мутации, эволюцию. Такое внимание к ретрови-русам обусловлено их исключительными особенностями. Они широко распространены у позвоночных, передаются как горизонтально, так и вертикально, являются природными агентами онкогенеза, для размножения используют РНК-зависимый синтез ДНК. В последнее время интерес к ретровирусам еще более обострился в связи с установлением этиологии синдрома приобретенного иммунодефицита и Т-клеточного лейкоза человека.
Ретровирусы обнаружены практически у всех высших животных, однако, для каждого данного ретровируса круг хозяев чрезвычайно ограничен. Вместе с тем имеются хорошо документированные описания расширения или изменения круга хозяев. Чем обусловлена специфичность ретровирусов, какие условия и какие изменения в них необходимы для смены хозяина? Ответы на эти вопросы не только возбуждают теоретический интерес, но и приобретают большое практическое значение. "Адаптация" куриного вируса саркомы Рауса (rsv) к условно пермио-сивному хозяину, утиным клеткам, - прекрасная модель для подобных исследований.
Хотя ретровирусы являются только одним из агентов, приводящих через специфические генетические изменения в индиввдуальных клетках к злокачественному перерождению, их привлекательность для исследователей в области канцерогенеза об"ясняется относительной простотой строения и надеждой, что детальное понимание генетического вклада, вносимого этими вирусами в клетку, расширит в целом наше понимание неопластического превращения, rsv предоставляет экспериментаторам наиболее удачную ситуацию: он внедряет в нормальную клетку единственный ген, чей продукт споообен инициировать и поддерживать опухолевый фенотип. Действительно ли ген src всегда необходим для поддержания злокачественной трансформации клетки или, раз инициировав этот процесс, он может быть элиминирован? Клетки млекопитающих, трансформированные вирусами птичьих сарком, непермассивны для этих вирусов, что позволяет длительное исследование их сохранения в условиях, исключающих повторное заражение.
rsv при длительном пассировании легко теряет частично или полностью ген arc, что приводит к появлении нетрансформирующих мутантов. Механизм образования таких трансформационно-дефектних (td) мутантов удобно исследовать при заражении вирусом саркоми Рауса клеток уток, исходно не имеющих Ksv-гомологичных последовательностей. Использование td -мутантов rsv чрезвычайно полезно для изучения путей трансдукции клеточного протоонкогена и превращения его в вирусный онкоген, понимания способов образования нових остро трансформирующих ретровирусов.
Таким ооразом, изучение организации, структуры и экспрессии вируса саркоми Рауса в клетках несвойственных для него хозяев дает возможность получить ответы на многие актуальные вопросы, относящиеся к молекулярной биологии ретровирусов и проблеме возникновения злокачественных новообразований.
Целью настоящей работы было выяснение молекулярных основ образования новых ретровирусов и их необходимости в поддержании индуцированного ими опухолевого фенотипа. Для выполнения работы на моделях, разрабатывающихся совместно с Институтом молекулярной генетики ЧСАН и представляющих собой rsv-трансформированные клетки различных животных, предполагалось последовательное решение нескольких задач. Прежде всего, интересно было узнать, на каких этапах жизнедеятельности rsv происходит ингибирование его репликации в условно пермиссивных для него утиных клетках и какие изменения необходимы для его приспособления к новому хозяину. Многократное пассироваше Rsv на утиных клетках генерирует, наряду с образованием "адаптированного" к уткам трансформирующего вируса, большое количество тран-сформационно-дефектного мутанта. Выяснение его структуры было последующей задачей этого исследования. После инфицирования таким td-мутантом в раннем возрасте здоровых цыплят, у взрослых кур иногда обнаруживали саркомы, продуцирующие вирус. Определение организации и структуры этого вируса оказалось полезным для понимания механизмов образования саркомных вирусов, а последующее изучение наличия вирусспецифических нуклеотидных последовательностей в клетках млекопитающих, изначально трансформированных rsv, помогло обнаружить отсутствие отрогой их необходимости для поддержания опухолевого фенотипа.
Научная новизна. Проведено детальное изучение организации и структуры провирусов, имеющих общее происхождение (вирус саркомы
Рауса ), но измененных в соответствии с условиями эксперимента на пути к образованию новых ретровирусов: трансформационно-активного и трансформационно-дефектного, заражающих клетки другого, несвойственного для Rsv вида животных, а также нового саркомного вируса птиц. Впервые получена и определена нуклеотидная последовательность провируса pr-RSv-c, адаптированного к утиным клеткам (daPr-Rsv-c), выделен и охарактеризован его трансформационно-дефектннй мутант (td dapr-Rsv-c). в обоих вариантах вируса обнаружена изменения в гене env, имеющие значение для адаптации к несвойственному хозяину.
Расшифрована первичная структура провируса нового остро-трансформирующего вируса, вызывающего саркомы у птиц, который был выделен из опухоли, индуцированной у цыпленка внутриэмбриональной ин"ек-цией td daPr-Rsv-c. Впервые показана трансдукцій гена c-src вместе с протяженным 3 -прилежащим участком хозяйской ДНК.
До последнего времени считалось общепринятым отсутствие какой-либо специфичности интеграции провирусов ретровирусов с хромосомной ДНК хозяйской клетки. В этой работе показано, что провирусные последовательности вируса саркомы Рауса в разных линиях клеток млекопитающих, трансформированных этим вирусом, локализуются преимущественно в gc- богатых участках генома.
Принципиальным является обнаруженный в данной работе и на той же модели другими авторами (Tatosyan et аі.,1986) факт, что для поддержания опухолевого фенотипа нет обязательной необходимости сохранения в геноме трансформированной клетки ни нуклеотидных последовательностей репликативных генов ретровируса, ни нуклеотидных последовательностей самого онкогена, инициировавших этот процесс. В патогенез опухолевого заболевания могут вовлекаться другие онкогены, активированные вирусными промоторами, либо изменившие свою структуру в результате перестановок в геноме, вызванных первичной трансформацией.
Теоретическая и практическая ценность. Результаты описанных в работе исследований расширили существующие представления об образовании новых ретровирусов, молекулярных механизмах перехода ретровирусов от одного хозяина к другому, превращения саркомных вирусов в трансформационнс-дефектные мутанты, которые можно отнести к лейкоз-ной группе медленно трансформирующих вирусов. Особенно ценно, что такой круг превращений был показан на одной модели - Rsv-трансфор-мированных клетках специфических и неспецифических хозяев. Таким
4 образом, продемонстрирована сиотема для распространения и сохранения ретровирусов, роль которых в природе, по-видимому, далеко выходит за рамки онкогенеза.
Молекулярно-биологические исследования адаптации rsv к условно пермиссивному хозяину позволили сформулировать гипотезу о путях расширения круга хозяев ретровирусов и открыли возможность направленного изменения их хозяйской специфичности.
В процессе "адаптации" онкогешюго ретровируса к новому хозяину происходит накопление его td-мутанта. Выделение и характеристика td daPR-Rsv-c позволили нарисовать схему их образования из трансформационно-активного Rsv и использовать в дальнейшем эти мутанты после определенных модификаций в качестве вектора для переноса чужеродных генов в клетки птиц.
В природе, однако, как было показано в работе, такие td-мутанты могут рекомбшшровать с клеточными протоонкогенами, давая в результате трансформирующие ретровирусы. Определенная в работе структура нового птичьего саркомного ретровируса подтверждает высказанную ранее ГИПОТезу ХанафуЗЫ (Lerner, Hanafusa,1984), ЧТО
изолят, известный сегодня под именем "Пражский штамм вируса саркомы Рауса", - это результат вторичной рекомбинации исходного репли-кативно-дефектного саркомного вируса.
one-содержащие ретровирусы, как репликативно компетентные, так и репликативно-дефектные, вызывают трансформацию клеток in vitro и возникновение опухоли in vivo и, как считалось до сих пор, необходимы для дальнейшего поддержания опухолевого фенотипа. Полученные в работе результаты указывают на то, что второе не всегда необходимо, из чего следует важный вывод: ретровирусная этиология рака встречается чаще, чем это можно выявить доступными сегодня методами.
Использование подхода, разработанного Дж.Бернарди для фракционирования длинных фрагментов ДНК по их GC-составу, позволило обнаружить, что интеграция провируса происходит не статистически, а распределяется по определенным сегментам гомогенной по нуклеотидно-му составу ДНК большой протяженности, называемых изохорами. Открытие такой предпочтительности в интеграции ретровирусных провирусов создает перспективы для дальнейшего исследования районов клеточного генома, участвующих в поддержании опухолевого фенотипа.
Разработанные при выполнении этой работы в рамках международ-
ных программ АН соц.стран "Обратная транскриптаза (ревертаза)" и "Ревертаза-онкоген" методические приемы получения препаративных количеств обратной транскриптазы и синтеза полноценных кДНК способствовали как развитию работ, явившихся предметом этой диссертации, так и созданию научно-технической базы для получения клонотек кДНК вирусов, растений и животных в нашей и других лабораториях страны.