Введение к работе
1;_,^J1
Актуальность проблемы. Изучение вирусных геномов на уровне гервичной структуры является одной из актуальных задач молекулярной іиологии. Знание последовательности нуклеотидов РНК или ДНК вируса гозволяет построить модель организации и экспрессии генома, надвинуть обоснованные гипотезы о функциях его участков или іелковнх продуктов иа.основе теоретического анализа нуклеотидных ели аминокислотных последовательностей. Достигнутый таким образом ачественно более высокий уровень представлений об исследуемом ібьекте в сочетании с появившейся возможностью легко применять іетодн . генетической инженерии позволяет эффективно проводить іункциональпне исследования. Наиболее впечатляющие успехи ювременной молекулярной вирусологии базируются на изучении ікспрессіш клонированных нормальных или несущих искусственно поденные мутации геномоз или отдельных генов.
Структура генома - это важный признак, применяемый в :истематике вирусов. Его наиболее консервативные участки іспользуются для построения гипотетических эволюционных схем. За гаследние шесть лет сравнительного изучения первичных структур іирусннх генов и их продуктов пройден путь от обнаружения сходных частков между последовательностями аминокислот РНК-полимераз
ШКОТОрЫХ (+)РБК-ВИруСОВ бактерий, растений И ЖИВОТНЫХ (Kamer,
.rgos, 1984) до установления консервативности строения И, ю-видимому, общности происхождения этих важнейших для репликации )ерментов для всех РНК содержащих вирусов, включая ретровирусы с
)ДНОЙ СТОрОНЫ И (-)РНК-СОДержаЩИе ВИРУСЫ С ДРУГОЙ' СТОРОНЫ (Poch et
.1., 1989). Таким образом, РНК-содержащие вирусы можно досматривать . как большой ряд родственных форм, приспособившихся [ля осуществления стратегически различных способов репликации и репрессии геномов. В то же время анализ структуры других генов івидетвльствует о ключевой роли рекомбинационных процессов происходящих, в том числе, с участием нуклеиновых кислот клетки) в
ЮЗНИКНОВеНИИ И ЭВОЛЮЦИИ ВИРУСОВ (Zimmern et al, 1988).
.. Помимо вклада в изучение проблем фундаментальной науки пределение первичной структуры генома вируса дает необходимую існову для решения таких важных прикладных задач как разработка пособов защиты от вирусной инфекции, создание новых векторных истем и т.д.
Большинство описанных вирусов в качестве генетическо: материала содержат одну или несколько молекул РНК. Разнообраз; организации и способов экспрессии в сочетании с неболыип размерами делают РНК-геномы исключительно привлекательны] объектами исследований. Значительную часть. множесті (+)РНК-содержащих вирусов составляют вирусы растений. К настояної времени определены структуры геномов примерно трех десяти представителей этого класса. Анализ выведенных аминокислоты последовательностей кодируемых ими продуктов, В ОСНОВ1Ч репликативкых белков, показал, что большинство (+)РНК-содерг;ац вирусов растений может быть отнесено к одной из двух супергрупп "Синдбис-юдобным" и "Пикорна-подобным", включающим виру і
ЖИВОТНЫХ (аЛЬфаВИруСЫ И ГШКОрНаВИруСЫ, СООТВеТСТВеННО) (Goldbac!
1987). к первым относились тобамо-, тобравирусы, гордеи-, кукумо илар-, бромо- и фуровирусы, ко вторым - комо-, кепо- и потивирус: Таким образом впервые была создана наиболее естествепп классификация растительных (+)РНК-вирусов. Она не обнаружила корреляций с такими важными биологическими характеристиками к спектр хозяев, тип строения вириона или количество молекул РНК геноме - эти признаки оказались вторичными!.
Суммируя сказанное, можно выразить уверенность, ч определение структуры генома каждого нового представите РНК-содержащих вирусов не только слукит развитию части вирусологии и дополняет перечень способов устройст молекулярно-генетических систем, но и помогает выявлен общебиологических закономерностей организации и эволюции итого.
Структура геномов потексвирусов к моменту выполнения настояв работы описана не была. Объектом исследования был выбран Х-вир картофеля (ХЕК) - типовой представитель этой группы. Гибк нитевидные вирионы ХВК состоят из субъединиц белка оболочки молекулярной массой около 26 КДа и единственной молекулы (+)РНК молекулярной массой 2,1 ВДа (Purcifull, Edwardson, 1981). Эта F кэпирована на б'-конце и полиаденилирована на З'-кони Последовательность нуклеотидов з'-концевой области генома ХВК бы определена ранее (Морозов и др.1986, Worozov et al., 1987). в ві участке РНК ХВК был идентифицирован ген белка оболочки и обнарухе примыкающие к нему со стороны 5'-конца две небольшие nej врывающиеся открытые рамки трансляции (ОРТ) - потенциальные геп способные кодировать гидрофобные полипбптиды с М.в.12 КДа и 7 КД
Цель и задачи исследования. Целью представленной работы было: ) установление нуклеотидной последовательности кДНК клонов, ірзкрнвапцих весь геном ХВК (кроме гена белка оболочки) и шедение па этой основе полной первичной структуры РНК ХЕК. і теоретический анализ полученной последовательности РНК ХВК с >лыо установления количества и порядка располааепия генов и ідвізения гипотез о воа\;о;зшх функциях белковых продуктов этил: шов на основе сравнения с белісами других вирусов или клеточными элкагл на уровне аминокислотных последовательностей, і установление систеї^атлческого положения потексвирусов среди эугих (+)РНК-содер2ащих вирусов.
Научная норигэда и практическая ценность роботи. В настоящей 'боте впервыо установлена последовательность нуклеотидов РНК ХВК. го первый пример определения полной первичной структуры генома їруса в СССР.
В процессе работы были получен набор Н13 клонов -?. их Уклонов, содержащих последовательности нуклеотидов всего ггяома ЗК в виде одноцепочочной ДНК. Эти клоны используются для пьнейшего изучения ХБК мзтодаст рзкомбинантннх ДНК в ИМБ АН СССР на кафедре вирусологии Биологического факультета МГУ км. .В.Ломоносова.
На основании анализа первичной структуры РНК ХВК и вируса
эзаики белого клевера (ЕЖК) впервые описана организация генома
этексвирусов с указанвм его вариабельных и консервативных районов,
показаны обоснованные предпслснения о возможных функциях продуктов
орвых двух генов потексзирусоз на основе анализа их выведенных
'япгокислотных последовательностей. Обпарухено неожиданно высокое и
гатистически достоверное сходство аминокислотных
оследовательностей продуктов 0РТ1 потексвирусов и вируса желтой
эзаики турнепса (ЕШТ, семейство тимовирусов), в то время как
олковый продукт 0РТ2 проявлял наибольшее сходство с
оответствукцими белками фуровирусоз и гсрдеивирусов."^ В овокуппости с уке имевЕимися данными по продуктам ОРТЗ, 0РТ4 и елку оболочки (Morozov et al.,1987) обнаруженные "родственные вязи" ХЕК дают дополнительные свидетельства в пользу представлений существенной роли рекомбинационных событий в возникновении и волюции вирусов.
Полученные результаты имеют такяе большое значение и для рикладных работ. ХВК наносит ощутимый урон сельскому хозяйству,
сникая урожай картофеля примерно на 20%. На основании данных первичной структуре РНК ХВК в Отделе рекомбинантных ДНК ИМБ АН С( успешно проводятся работы по созданию растений, устойчивых к XI Перспективно также использование регуляторних участков генома ) для конструирования высокоэффективных систем экспрессии чукеродд генов.
Апробация работы состоялась на заседании научного колпокви; N21 Отдела рекомбинантных ДНК ИМБ АН СССР им В.А.Энгельгардта мая 1Э89 года.
Материалы исследований по теме диссертации 'доложены Международном симпозиуме "Генетическая инженерия растоіі; (г.Пущино, 1-3 октября 1987 года), школах-конференциях mojioj ученых (г.Алушта, 20 октября-1 ноября 1987 года и г.Албої Болгария, 18-23 сентября 1988 года), xvi конференции молодых учен ИМБ АН СССР, 27.04.1988,(2 премия) и на конкурсе работ коло; ученых институтов АН СССР Октябрьского района г.Москвы 1988 года премия).