Введение к работе
I.I Актуальность проблемы, изучение регуляции экспрессии сложных полнинстронных матриц, к числу которых принадлежат многие вирусные мрнк, а также нРНК, кодируемое бактериофагами, является важным направлением современной молекулярной бноло-гин. осіїЬиіі интерес нрелстанляет иэучсшш процессор гршігкрин иин и трансляции поздних генов бактериофага Т4, кодирующих структурные белки вируса.
Хотя в морфология частицы бактериофага Т4 изучена довольно полно, отдельные черты инфекционного процесса остаются неясными, правильная сборка частицы фага в клетке возможна только при скоординированном синтезе всех структурных белков вирусной частицы. Кластерное расположение генов позволяет вирусу, изменяя специфичность узнавания РНК-полимераэой различных промоторов фага, схоорднннровать процесс транскрипции по времени и уровню копий м-РНК, обходиться сравнительно небольшим количеством единиц транскрипции в геноме. Выяснение особенностей данного механизма регуляции важно для понимания многих фундаментальных процессов, в том числе регуляции и сборки вирусов.
Изучение таких сложных белковых структур, как базильні.я пластинка бактериофага Т4, может кисть важное практическое значение. Многие полипептиды, входящие в ее состав, рассматриваются нами в качестве перспективных моделей для белковой инженерии и создания гибридных молекул, содержании антигенные детерминанты вирусов человека.
данная работа была начата в лаборатории 'Молекулярной генг--тнки" института вирусологии им. Д.Н.Ивановского в рамках тепы по изучению регуляции фоллинга вирусных белков и научного проекта Всемирной организации Здравоохранения 'Идентификация антигенных детерминант вируса гепатита А и их экспрессия в составе гибридных белков". В качестве векторных молекул для приведения белковой инженерии нами были предложены структурные белки бактериофага Т4. На первом этапе было необходимо определить последовательность ДНХ генов, кодируют!х белки Паэальной пластинки и создать эффективные системы их экспрессии.
1.2. Цель и задачи работы. Настоящая работа была направлена на изучение так называемой поздней области генома бактериофага Т4, кодируюаей гены баэальнон пластинки, и создание высокоэффективных систем экспрессии белков - продуктов этих геноз.
для будущего их использования в качестве векторных молекул при белковой инженерии.
Основными задачами исследования явились.
і. клонирование и определение полной нуклеотидную после -довательность поздних генов 6, 7, 8, 9, 10. U, 12, wac, із. 14, 15 бактериофага Т4.
2.''создание высокоэффективных систем экспрессии клониро
ванных генов, с целью получения белков в препаративных коли
чествах. '
1.3. Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые определена полная нуклеотндная последовательность ЛН< генов с 6 по 15 бактериофага Т4, составляющая 15712 пар нукле-отндов.
Обнаружены две большие единицы транскрипции, каждая из' которых имеет собственный поздний промотор ТЛТЛААТА. Одна из них содержит гены 6, 7, 8 и небольшую открытую рамку считывания после промотора. Вторая единица транскрипции включает 9, 10, 11, 12, wac, із, 14. Характерной особенностью данных областей генома фага T4 является перекрывание инициирующих и терминирующих колонов соседних генов между генами с б по 8 н с 9 по'йас.
Созданы векторы экспрессии, позволяющие нарабатывать в клетках Е. coli продукты генов 9, 10, 11, 12 и wac в препаративных количествах.
1 Полученные результаты расоирилн представления о регуляторних механизмах используемых фагом Т4 при репродукции, а также дали информацию о структуре генов двух единиц транскрипции и их белковых продуктах.
Результаты данной работы имеют важное значение для дальнейших исследований по механизмам белкового фолдинги, а также для развития методов белковой инженерии с целью создания гибридных молекул для медицинских целей.
1.4 Апробация работы. Работа была доложена на заседании Ученого Совет» "Молекулярная биология" по предварительной :»кс-перткэе диссертаций при Институте вирусологии АМН СССР и иа VIII Вирусологическом Конгрессе, Берлин, август 1990 г.
t.5 объем и структура работы, диссертация состоит из введения, обзора литературы, методической части, результатов исследований, обсуждения и выводов. Общий объем работы составляет
138 стр. машинописного текста. Полученные результаты иллюстрированы і таблицами и 16 рисунками. Список литературы включает 166 нанмеїіоішішії.
I.6 Положения пыноснмые на защиту.
-
В районе генома бактериофага Т4 с координатний 79.з із - 94. чао расположены лпе единицы транскрипции, находящиеся (Н'.Л контролем поздних промоторов ТЛТЛЛЛТЛ. особенностью исследуемой области является перехрыванне между инициирующими и терминирующими колонами соседних генов в рамках последовательности АТО А.
-
Векторы экспрессии на основе промотора для РНК-полиме-разы фага Т7 позволяют получать белки, продукты генов 9, ю, И, 12, wac, в препаративных количествах в клетках Е. coli. _
-
Продухты генов 9,11 и wac являются наиболее перспективными для их использования в качестве векторных белков-носителей для проведения белковой инженерии и встраивания антигенных детерминант вирусов человека.