Введение к работе
Актуальность проблемы
Одним из наиболее опасных и быстро распространи г>н щ іея в последнее время вирусных заболеваний является инфекция, вызываемая вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ-инфекция), получившая в фазе клинических проявлений название СПИД (синдром приобретенного иммунодефицита). Развитие этого заболевания, связанного с преимущественным поражением иммунной системы организма и сопровождающегося присоединением оппортунистических инфекций и неопластических заболеваний, неизбежно приводит к летальному исходу. Со времени появления этого заболевания число заболевших, по официальным данным на 1994 год, составляло более 3 миллионов человек, а число инфицированных ВИЧ превышало 15 миллионов человек.
Этиологический агент СПИД - вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), относящийся к семейству ретровирусов (подсемейство Lentivirinae), был открыт в 1983 году (Montagnier et al., 1983). Специфической мишенью для этого вируса служат хелперные Т-лимфоциты, в которых происходит размножение вируса (Hatzman et al., 1984; Dalgliesh et al.,1984). Кроме того, показано, что моноциты и макрофаги также могут быть инфицированы ВИЧ (Gartner et al., 1986; Growe et al., 1987).
Рецептором для ВИЧ на чувствительных к вирусу клетках служит С04-диференцировочяый антиген (CD4-рецептор), с которым взаимодействует поверхностный гликопротеид gpl20 ВИЧ (Sattentau et ah, 1984).
Зрелая молекула С04-рецептора имеет молекулярную массу 55 кД и состоит аз внеклеточного сегмента (372 аминокислоты), представляющего собой четыре тандемно расположенных иммуноглобулннподобных домена, трансмембранного (23 аминокислоты) и цитоплазматического (38 аминокислот) участков (Maddon et al., 1985). Кроме того, как большинство мембранных белков, CD4-peneirrop имеет ладерный пептид размером 23 аминокислоты. Ключевая рать в процессе взаимодействия С1)4-реп.ептора с gpl20 ВИЧ принадлежат первым двум иммуноглобулинподобным доменам СХ>4 (Harrison et al., 1988). Первый вммуноглобулинподобкый домен CD4
(vl) имеет около 40% гомологии с вариабельными участками легких цепей иммуноглобулинов и аналогичную пространственную структуру (Maddon et al., 1986).
CD4-peu,eirrop экспрессируется на поверхности хелперкых Т-лимфодитов (50-70% всех циркулирующих лимфоцитов), моноцитов и макрофагов (Ledbetter et al., 1981; Gartner et al., 1986). Этот гликопротеид играет важнейшую роль в актигензависимой Т-клеточной активации, участвуя, таким образом, в формярования клеточного иммунного ответа (Biddison et al., 1984). Одним из главных свойств Т-лимфоцитов, экспресси-рующих CD4-penenrop, является способность взаимодействовать с мишенями, несущими молекулы П-го класса, главного комплекса гистосовместимс-ств (ГКГС) (Meuer et al., 1982). Предполагается, что молекулы CD4-рецептора, обладая адгезивными свойствами, связывают неполиморфный участок антигенов П-го класса и, таким образом, стабилизируют комплекс между молекулами класса П ГКГС, несущими или не несущими пептидный антиген, и рецептором Т-клетки (Sette et al., 1987). До недавнего времени 'считалось, что Т-клетки, экспрессирующие С1)4-рецептор, могут выполнять в иммунной системе либо хелперную, либо индуцирующую функции, то есть либо проводить сигналы активации к В-лимфоцитам, либо индуцировать Т-лимфоциты, несущие CDe-дифференцировочный антиген, для выполнения последними цитотоксической функции. Сейчас функции CD-рецептора представляются более широкими, так как обнаружены цитоток-сические CD4+ клетки, которые могут играть регуляторную роль в иммунной системе. В настоящее время можно говорить о следующих свойствах молекул CD4: способность связываться с комплексом CD3/Ti; комодулиро-вакие с комплексом рецептора Т-клеток; активирование Т-клеток в системе специфического лиганда, как например, комплекс антиген-молекула ГКГС П-го класса; прямое участие в запуске активации Т-клеток (Habeshaw et al., 1989). Поскольку, моноклональные антитела на различные участки молекулы CD4-peuerrropa по разному влияют на все эти функции, можно говорить о том, что CD4-рецептор играет полифункциональную роль в иммунной системе, помимо взаимодействия с молекулами ГКГС Д-го класса.
5 Кроме того, как уже говорилось, молекула CD4 служит рецептором
для ВИЧ, и взаимодействие вирусного гликопротеида gpl20 и CD4 является ключевым моментом в патогенезе ВИЧ-инфекции. Высокий аффинитет связывания вирусного белка с СБ-і-рецептором обусловливает прикрепление и проникновение вирусных частиц в клетку и индуцирует дисфункцию и истощение неинфицированных CD4+- Т-лимфоцитов через широкий круг различных механизмов.
Если аминокислотная последовательность и структура самого CD4-рецептора, относящегося к суперсемейству иммуноглобулинподобяых белков, известна и достаточно хорошо изучена, то в мировой литературе, до последнего времени, не было никаких данных о нуклеотидной последовательности и структурной организации гена, ответственного за синтез этого белка. Получение такой информации могло бы дать новые сведения об эволюции и механизмах экспрессии гена С04-рецептора, в частности, и всего суперсемейства иммуноглобулинподобных белков в целом. Исходя из этого, нами были проведены попытки клонирования и изучения структуры гена, ответственного за синтез CD4-peneirropa.
Способность СВ4-рецептора связывать ВИЧ теоретически предполагает возможность его использования в качестве противовирусного агента при ВИЧ-инфекции. Впервые возможность такого использования СШ была показана в системе in vitro в 1988 г. несколькими группами авторов (Fisher et al., 1988; Deen et al., 1988). В этих работах использовались раз-, личные растворимые формы рекомбинантного белка CD4, выделенные как из про- так и эукариотичееких клеток. Однако, при клинических испытаниях таких препаратов значительного противовирусного эффекта достигнуто не было. Тем не менее, следует подчеркнуть, что в настоящее время не существует подхода к созданию лекарственных препаратов для лечения ВИЧ-инфекции, который мог бы претендовать на монополию. Скорее всего, как н для ряда других инфекционных заболеваний, эффективная терапия ВИЧ-инфекции будет заключаться в применении комплексного подхода, когда в зависимости от стадии или формы проявления заболевания будут использоваться сочетания лекарственных средств с разными механизмами действия или их различные комбинации. Поскольку, сколько-нибудь
надежных препаратов ингибирующих стадию взаимодействии ВИЧ с чувствительными клетками кока нет, дальнейшее изучение возможности использования для этих целей различных рекомбияантных производных CD4, не представляется бесперспективным.
Кроме того, различные рекомбиваятвые производные CD4-рецептора могут в уже успешно применяются в различных моделях для изучения механизмов взаимодействия ВИЧ с чувствительными клетками, для очистки и изучения вирусных белков gpl20 и gpl60. Исходя из этого, вами проводилась работа по получению мутантных s других рекомбвнантных форм СІМ-рецептора, которые можно было бы использовать для этих целей.
Настоящая работа выполнялась в рамках исследований Государственной научно-технической программы "Борьба с наиболее распространенными заболеваниями" по проблеме СПИД (темы № 70,133,313,424).
Цели и задачи исследования.
Основными целями настоящего исследования были: 1)изучение особенностей структуры и экспрессии гена, ответственного за синтез CD4-pe-цептора, 2) поиск препаратов ва основе различных рекомбинантных форм CD4-peneirxopa, эффективно ингибирующих ВИЧ-инфекцию, 3) изучение возможности 'использования CD4- рецептора для направленной доставки антивирусных препаратов в клетки, зараженные ВИЧ.
Для достижения поставленных целей в ходе работы было необходимо решить следующие задачи:
1. Клонировать участки гена СБ4-рецептора и определить нуклео-
тидную последовательность клонированых фрагментов этого гена. -
2. Провести компьютерный анализ нужлеотидвой последовательнос
ти и сравнительный анализ с имеющимися последовательностями генов
иммувоглобулинподобных белков.
-
Клонировать кДНК &>4-рецептора и сконструировать реком-бинантные дладмидк, способные обеспечить в бйягеркя* Escbericraa coli синтез растворимых форм СОД-рецептора.
-
Синтезировать мутантные формы (Л)4-рецептора с мутациями в участке взаимодействия с гликопротевдом gpl20 ВИЧ.
-
Сконструировать рекомбинанткыв плазмиды, обеспечивающие в бактериальных клетках синтез гибридных белков, состоящих та участка CD4-penenTopa, ответственного за связывание, с ВИЧ и функциональных субъединиц токсинов бактериальной природы.
-
Получить конъюгаты СГН-рецещора с препаратами ингибн-рующими размножение ВИЧ в инфицированных ВИЧ клетках.
-
Изучить в системе in. vitro способность полученных рекоибинант-ных форм СВ4-репептора. ингибировать репродукцию ВИЧ и возможность их использования для аффинной очистки вирусспецифическвх белков.
Научная новизна работы
В результате выполнения настоящих исследований получены новые данные, имеющие как теоретическое, так и практическое значение.
Получена геномная библиотека ДНК и клонированы участки гена ответственного за синтез CD4-penerrropa Т-лимфоцитов человека. Впервые определена нуклеотидная последовательность 5'-концевого участка гена СВ4.рецептора, включающего в себя три первых экзона и интроиа гена CD4-penenropa, получены данные о структуре этого участка гена.
Идентифицирован новый, ранее на описанный LTR эндогенного рет-ровируса HERV-K; Впервые установлено, что Alu-повторяющиеся последовательности могут встраиваться в LTR эндогенных ретровирусов. Показано, что нитроны гена CD4 содержат открытые рамки считывания я участки альтернативного сплайсинга для близкородственных белков. Предложена новая вторичная структура Alu-повторов ДНК.
Клонирована кДНК гена СС4-рецептора и получены рекомбинант-ные плазмиды, экспрессирующие в клетках Exoli рекомбинактные пронз-всдные CD4.
Получены рекомбинактные- иммунотокснны, состоящие из С04-ре-цептора и функциональных участке», дифтерийного токсина и токсина Pseudomonas. В системе in vitro изучена их антивирусная активность. Вы-' явлен новый препарат L-лизиноксядаза, ингибирующий ВИЧ-инфекцию, и получены конъюгаты этого препарата с CD4-рецептором, увеличивающие специфичность и эффективность препарата.
* Основные положения, выносимые на зашиту
-
Стратегия клонирования участка геномной ДНК Т-лимфоцитов человека (13,1 Т.П.Я.), включающего в себя б'-концевой фрагмент гева CD4-редептора и определение его нуклеотидной последовательности.
-
Анализ нуклеотидной последовательности клонированного участка гева CD4-рецептора, включающего в себя первый, второй в третий экзо-ны; первый, второй ивтроны в часть третьего нитрона этого гена. Установлено, что первые три экзова гева С04-рецептора кодируют нетранслируе-мый участок мРНК, лидерный пептид в большую часть первого иммуног-лобулинподобного домена СБ4-рецептора.
-
Анализ структуры экзонов гена СВ4-рецептора. Обнаружено, что нуклеотидвая последовательность, кодирующая первый иммуноглобулин-подобный домев CD4-pen,enTopa, прерывается нитроном, что крайне нехарактерно для белков иммуноглобулннового суперсемейства в дает новые представления об эволюции вктровов вообще.
-
Анализ структуры нитронов гена СШ-рецептора. Установлено, что интроны гена С04~рецептора содержат 14 Alu-повторов ДНК в прямой я обратной ориентации, которые могут принимать участие в эволюционных процессах и регуляции генов иммувоглобулинподобяых рецепторних белков. В ввтронах гева СШ-рецептора обваружен новый HEK.V-K элемент в рамка считывания для белков с высокой степенью гомологии с белком BCGF в белками DAF в С0М5 из- системы комплемента, с участками альтернативного сплайсинга.
б. Стратегия клонирования кДНК CD4-penenropa, определение ее нуклеотидной последовательности в получение растворимых рекомбинавт-ных форм СШ-рецептора, эффективно взаимодействующих с рекомбияавт-ным и нативным гликопротеидом gpl20 ВИЧ и ингибирующих в системе in vitro репродукцию вируса.
. 6. Получение и характеристика рекомбвнантных нммунотоксяяов, состоящих вз участка С04-рецегхгора, ответственного за связывание с ВИЧ и различных каталитических доменов токсинов бактериальной природы. Изучение их стабильности я антивирусных свойств.
-
Синтез мутантних производных СБ4-рецептора для изучения механизмов взаимодействия CD4 с gpl20 ВИЧ и получение клеток бактерий, экспрессирующих мутантные белки.
-
Показано, что С1Э4-рецептор, коныогированный с ингибитором ВИЧ-лизиноксидазой, позволяет снизить в несколько десятков раз дозы ингибитора при подавлении репродукции ВИЧ в системе in vitro.
Практическая ценность роботы
По материалам диссертации получено 3 авторских свидетельства на изобретения и 8 патентов Российской Федерации.
Полученные рекомбинантные формы CD4-Morjrr применяться для аффинной очистки вирусных антигенов gpl20 и gpl60 ВИЧ из вирусных лизатов для приготовления диагностических тест систем и возможных вакцинных препаратов. Полученные в результате работы моноклинальные антитела могут использоваться для очистки рекомбинангных и нативных белков ВИЧ для создания различных препаратов как для диагностики, так и для профилактики СПИД.
Полученные во время выполнения работы рекомбинантные плазми-ды, защищенные патентами Российской Федерации и авторскими свидетельствами, высокоэффективно экспрессирующие участки генома ВИЧ1 и ВИЧ2, могут быть использованы и частично используются для разработки диагностических препаратов.
Лизиноксидаза, антивирусные свойства которой изучались в настоящей работе, может быть использована в клинике для лечения вирусных заболеваний, в том числе ВИЧ-инфекции.
Апробация работы
Основные экспериментальные материалы и положения диссертационной работы были доложены и обсуждены на ЬХП сессии общего собраігая Академии медицинских наук (Москва, 1991), на Бюро отделения профилактически медицины РАМН (Москва, 1993), на VI, VIII, К, X Международных конференциях по проблемам СПИД (Сан-Франциско, 1990; Амстердам, 1992; Берлин, 1993; Иокагама, 1994), на советско-австралийском
симпозиуме по проблемам "Профилактики и леченая СПИДа" (Москва, 1990), на 1и 2 Международных конференциях "СПИД, рак и ретровиру-сы человека" (Санкт-Петербург, 1992,1993), Мезкдународкой конференции "Молекулярно-бнологические аспекты диагностики и терапии СПИД" (Новосибирск, 1992), ва Международной конференции "Молекулярная биология на рубеже XXI века" (Москва, 1994) в ряде других международных конференций.
Публикация работ
Основные положения диссертации отражены в 3 авторских свидетельствах, 8 патентах РФ, и 30 опубликованных научных работах.
Работа выполнена в плане научных исследований НИИ вирусных препаратов РАМН (директор - академик РАМН О. Г. Анджапаридзе) в лаборатории экспериментальной иммунологии. Основные результаты получены в соавторстве с сотрудниками НИИ ВП РАМН: Маяюшовой В. В., Сидоровым А. В., Пугачем А. В., Анджапаридзе О. Г., Шухминой Н. Р., Пияле Э. Р., Мельниковой Н. Л., Зайцевым И. 3., Гольцовым В. А., Алексеевым С. Б., Сухановой Л. Л., Алаторцевой Г. И.; Института молекулярной биологии РАН: Недоспасовым С. А.; НПО "Вектор": Блиновым В. М.; ВНИИГевети-ка: Здановским А. Г.; Института вирусологии им. Ивановского: Кущ А. А. Своим коллегам и соавторам проведенных исследований автор приносит искреннюю благодарность.