Введение к работе
Актуальность проблемы. И последние пять-восемь лет в мире интенсивно ведутся работы по изучению структуры геномов ' фитовирусс». Развитие этих работ обуслоатено как фундамен.лльным, так и прикладным интересом.
Значительный экономический урон, наносимый фитовирусаии, требует создания новых, псе более эффективных способов защиты растг ний. В нас гоящее время наиболее перспективными методами борьбы с вирусными заболеваниями растений становятся методы, основанные на знании молекулярной биологии вирусов и процессов их взаимодействия с растениями-хозяевами и переносчиками. Получение первых трансгенных растении, устойчивых к тем или иным вирусам - хорошее тому свидетельство.
Одной из наиболее важных сельскохозяйственных культур является картофель. Сегодня идентифицировано около двадцати наиболее патогенных вирусов, поражающих картофель. Одним из них является М вирус картофеля (МВК), являющийся типичным представителем карлавирусов - довольно слабо изученной с точки зрения молекулярной биологии группы фитовирусов. Ареал распространения карлавирусов довольно широк. Например, в СССР МВК и SBK (S вирус картофеля) заражены почти повсеместно все районированные сорта картофеля, часто в комплексе с X и У вирусами картофеля. В результате такой инфекции происходит снижение урожая на 30—50%, а в некоторых случаях на 80%.
Настоящее исследование посвящено изучению структуры и экспрессии генома МВК.
. Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было определение нуклеотидной последовательности протяженной 3— концевой области РНК МВК. Были поставлены следующие задачи:
получение библиотеки бактериальных клонов, содержащих ДНК-копии геномной РНК МВК;
отбор клоноа, содержащих кДНК-вставкн соответствующие 3-концевой области вирусной РНК;
определение нуклеотидных последовательностей кДНК— вставок в отобранных клонах;
— анализ кодирующего потенциала, аминокислотных
последовательностей белков, кодируемых протяженными открытыми рамками считывания (ОРС) и возможных регуляторних последовательностей РНК МВК;
- исследование механизмов экспрессии генома М вируса картофеля.
Научная новизна работы. В работе впервые опреде— лена нуклеотидная последовательность протяженной 3-концевой области генома карлавируса - М вируса картофеля. Установлено сходство структурной организации геномов карла-' и потексвирусов и высокая степень гомологии белков, кодируемых соответствующими ОРС. Изучены возможные механизмы экспрессии 3-концевых цистронов генома МВК.
Практическая ценность работы. Получена плазмида pGKIS, содержащая ген белка оболочки МВК. Эту плазмиду предполагается использовать для создания трансгенных растений картофеля, экспрессирующих белок оболочки МВК, что должно придать растениям устойчивость к этому вирусу. Возможность создания таких растений подтверждается экспериментами MacKenzie & Tremaine (1990), получившими трансгенные растения, эхспрессирующие капсидный белок S вируса картофеля. При заражении этих растений как интактным вирусом, так и вирусной РНК не происходит развития симптомов инфекции и накопления вируса ни в инокулированных, ни в молодых верхних листьях.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на Конференциях молодых ученых и специалистов ВНИИСБ в 1988-1990 гт, на Конференции "Проблемы и перепекшвы биотехнологии" (Братислава, январь 1989Х на V Научном Симпозиуме Социалистических Стран по Биотехнологии (Будапешт, сентябрь 1989), на VIII Международном Вирусологическом Конгрессе (Берлин, август 1990) и на школе FEBS "Геном вирусов растений: структура и экспрессия" (Рига, апрель-май 1991).
Публикации.'Основные результаты диссертации отражены в семи печатных работах, список которых приводится в конце автореферата.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, глав "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты и их обсуждение", заключения, выводов и списка использованной литературы, включающего 185 библиографических ссылок. Работа изложена на 106 страницах машинописного
текста, включая 8 таблиц и 24 рисунка.