Введение к работе
"''Л
гаций
"АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ: Одной из основных задач молекулярной млогии является установление механизмов реализации генетической ^формации у высших организмов. Многие аспекты действия этих зханизмов связаны со структурной организацией ДНК в хромосомах и роматине.
Большая часть нуклеотидных последовательностей генома высших ходит в структуру универсальных суб'единиц хроматина - нуклеосом. а последние годы наметился прогресс в понимании динамической рганизадии хроматина и взаимосвязи структуры хрокїосом и хроматина ,с онтролем экспрессии генов. В частности, получен убедительный ответ а вопрос 15-летний давности о том, может. ли иметь функциональный шел специфическое расположение нуклеосом - элементарных суб'единиц труктуры хромосом - вдоль кодирующих и некодирующих
ОСЛеДОВатеЛЬНОСТеЙ ДНК Генома (Grunstein et al. 1990) .
Парадоксально, что хотя уже имеется - немало данных о ункщганальной роли неслучайного расположения нуклеосом, механизмы х специфического позиционирования на ДНК до коша не. поняты. Более ого, до сих пор не ясно, определяется ли специфичность, главным бразом, за.счет участков, входящих в состав нуклеосомы, или за счет егментов ДНК, оставшихся вне нуклеосомы (возвджно, за счет ;ополнительных контактов с другими белками).
Настоящая работа как раз и посвящена одному конкретному аспекту ітой проблемы - получению усредненных структурных характеристик юнонуклеосомной ДНК, как возможного подхода к исследованию кзханизма позиционирования нуклеосом. Полученная информация могла бы :аюке способствовать лучшему пониманию организации ДНК в нуклеосоме.
Методология работы была ранее подробно описана Недоспасовым и :оавторами . (Nedospasov et ai., 1989). Идея молекулярного слонироваяия нуклеосомной ДНК была впервые использована в ранней >аботе лаборатории Г.П. Георгиева (Чувпило и др. 1982), а затем «зависимо была успешно применена в' ряде зарубежных исследований
[Bock et al. , 1984; Sat'chwell et. al., 1986; Ambrose et al., 1990).
Источником нуклеосом в настоящей работе являлся хроматин из 1' ійецитов периферической крови человека, а также мянихромосома sv40 (viiacoiviccxp.n модельная система для клеточного хроматина,-на которой
к моменту начала работы ухе были получены обширные экспериментальные данные). Индивидуальные и усредненные характеристики нуклеосоыных ДНК сравнивались.с результатами независимого анализа (satchweii et. зі., 198Б), которое представляет собой единственное имеющееся в литературе систематическое исследование свойств нуклеосомной ДНК, причем "сырые" экспериментальные данные были предоставлены нам авторами в виде компьютерных файлов.
ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ: Настоящая работа является частью исследований, проводимых в ВНК "Экспрессия эукариотических генов" в ражах ГНШ "Гансы человека" в Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта.
Конкретныш задачами работы являлось:
создание клоштеки шнонуклеосошой ДНК человека
определение нуклеоткдных последовательностей представительной выборки мононуклеосомюй ДНЯ человека
получение усреднении характеристик последовательностей мононуклеосоаной ІЛЇК человека и их сравнение с данными других исследовании
экспериментальная проверка гипотезы Крозорса (shrader ana crothers, 1989), о.том что "случайные" природные нуклеосомные ДНК слабо различаются по способности образовывать нуклессокы in vitro.
характеристика полученной коллекции субклонов ДНК геноаа человека поиском гомологии по базам данных расшифрованных последовательностей, а также по молекулярной гибридизации.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ: В настоящей работе впервые клонированы и изучены шнояуклессомше ДЯК из хроматика клеток человека, а также дополнены ранее полученные данные на минихромосоие sv4o. На основании сравнительного компьютерного анализа уточнены некоторые общие характеристики ДНК в нуклеосомах.
При помоци компвтерной обработки различных выборок расшифрованных последовательностей монокуклеосоынои ДНК подтверждены обнаруженные ранее (satchwaii et. ai., 1S86) общие закономерности, которые состоят б периодическом чередовании аа/тт и некоторых других дикуклеотидов с периодом около 10 нуклеотидов. С другой стороны,
выявлены систематические отличия в нуклеосомных ДНК из клеточного хроматина и из вирусной минихроыосомы в центральных областях нуклеосом. Интересно, что несмотря на существенные отличия в методике приготовления мононуклеосом и присутствия в наших препаратах хроматина гистона HI, главные усредненные характеристики минимальных нуклеосом совпадают. С другой стороны, расшифровка
ДОПОЛНИТелЬНОЙ ВЫборКИ МОНОНУКЛеоСОМНЫХ ДНК ИЗ МКНИХрОМОСОМЫ SV40,
приготовленных в условиях частичного удаления гистона HI, подтвердила усредненные данные 1984 г. и вновь подчеркнула отличия результатов для центральной области нуклеосош для клеточного и вирусного хроматина.
При помощи метода сравнительной количественной реконструкции индивидуальных мононуклеосомных ДНК в нуклеосош подтверждена, в целом, гипотеза Шредера и Крозерса о слабом вкладе нуклеотидной последовательности в энергетику образования нуклеосом. С другой стороны, экспериментальные данные по реконструкции некоторых мононуклеосомных ДНК из минихромосомы sv4o ставят под сомнение недавние результаты Вина и соавт. (Ambrose et ai. 1990) относительно закономерностей распределения нуклеосом вдоль ДКК минихромосомы и способствуют построению правильной модели, основанной на экспериментальных данных по молекулярному клонированию.
Проведен анализ коллекции мононуклеосомных ДНК человека с помощью поиска гомологии по базам данных нуклеотидных последовательностей, а также прямой гибридизацией некоторых индивидуальных нуклеосомных ДНК с суммарной ДНК человека. В результате охарактеризована коллекция коротких молекулярных зондов стандартной длины, которне могут быть применены для различных дальнейших работ по структурной организации хроматина и молекулярной организации генома человека.
В некоторых экспериментах, наряду с диссертантом, принимали участие С.А. Недоспасов, А.Н. Шахов, А.В. Ульянов, Д.В. Купраш и И.М. Гавин.
АПРОБАЦИЯ ДИССЕРТАЦИИ. Материалы диссертации были долокены на
2 конференциях:
-
Советско-французском симпозиуме "Организация и экспрессия оукагмотического и прокариотического генома" (Киев, 1990).
-
1'осетско-германском симпозиуме "Нуклеиново-белковое узнавание:
структурные и фармакологические аспекты" (Ленинград, 1991).
Основное содержание диссертации отражено в 3 печатных работах.
СТРУКТУРА И ОБ'ЕМ РАБОТЫ. Диссертация состоит из обзора литература и экспериментальной части, включающей новые методические разработки, а также собственные результаты и их обсуждение; заключения; выводов и списка цитируемой литературы.
Работа содержит страниц машинописного текста, рисунков,
таблицы. Библиография включает наименований.