Введение к работе
Актуальность проблемы: Исследования механизмов функционирования плазмидных генов привели к открытию ряда природных рибополинуклеотидов, способных регулировать механизмы трансляции-транскрипции в клетке. По аналогии с такими природными молекулами - были получены и искусственные комплементарно-адресованные полинуклеотиды, разделяемые на три основных вида по механизму взаимодействия с молекулой-мишенью. Это так называемые, антисмысловые РНК (асРНК), олигодезокинуклеотиды (олигоДН) и' рибозимы. Введение генов антисмысловых рибополинуклеотидов в живые клетки осуществляется с помощью векторов различной природы (плазмиды, ретро- или аденовирусные векторы), программирующих синтез асРНК или рибозимов, как методом трансфекции в клетки в опытах in vitro, так и с помощью микроиньекции в зародышевые клетки в опытах in vivo с получением трансгенных животных. В настоящее время показано ингибирование репродукции различных вирусов в "культурах клеток с помощью генов асРНК, в частности, RSV,- BLV, Adh5. HIV-I, PPV, HTLV-I и т.п. Кроме применения асРНК, другим быстро развивающимся подходом к подавлению вирусной инфекции in vitro, а главным образом, in vivo является применение олигоДН. Впервые специфическое ингибирование процесса трансляции in vitro синтетическими олигоДН было описано для белка, транслируемого с мРНК вируса саркомы Рауса (Stephenson, Zameonik, 1978). С тех пор олигоДН широко использовались в различных областях молекулярной генетики, а также разрабатывалось их применение в качестве терапевтических агентов нового поколения. В частности, ингибирующий эффект олигоДН в культуре клеток
продемонстрирован для вируса Сендай, VSV, EMV, HSV-I,- вируса гриппа, HIV-I и т.п. Однако, существенным недостатком олигоДН является быстрая деградация немодифицированных ДНК-молекул в средах, содержащих сыворотку крови или в кровяном русле животных, что ограничивает возможности широкого применения олигоДН. С целью увеличения эффективности действия олигоДН в клетках культуры и In vivo, разрабатываются различные формы их химической модификации, однако, механизм действия модифицированных олигоДН более сложен и включает также взаимодействие модифицированных молекул с клеточными белками (Wagner R.W., .1995, Stein С.А., 1995), обуславливая тем самым значительную неспецифическую, дозозависимую активность олигоДН.
Обнаружение каталитических свойств у полирибонуклеотвдов, получивших впоследствии название "риоозимы", дало новый толчок к поиску подходов в области генной терапии вирусных болезней, в частности ретровирусных заболеваний человека и животных. Появилось большое число работ по применению рибозимов для подавления инфекции, вызванной' HIV-I. Показано эффективное подавление вирусной инфекции рибозимами направленными -против участков вирусного генома, кодирующих трансактиваторные элементы таких вирусов, как HIV-I, HTLV-I, BLV. Несмотря на значительный прогресс в области антисенс- и рибозим-стратегии, ряд аспектов проблемы остается недостаточно изученным. Так например, поиск новых промоторных элементов, обеспечивающих высокую копийность антисшсловых транскриптов, а также возможность тканеспевдфической экспрессии антивирусных генов не потерял своей актуальности. Интенсивно исследуются подходы.к осуществлению адресной доставки (введения) антивирусных и лротивооухолевых средств непосредственно к больным клеткам. Значительный. интерес представляет также и
v'-:.-2.
сравнительный анализ ингибирупцего эффекта различных видов комплементарно-адресованных полинуклеотидов (КАП) на одной вирусной модели. Широкие возможности для исследования влияния КАП на репродукцию вирусов предоставляют клеточные культуры, in vitro моделирующие хроническую вирусную инфекцию. Подобные клеточные системы позволяют на ранних стадиях исследований оценить эффективность того или иного агента, не прибегая к дорогостоящим исследованиям на животных. Создание различных видов комплементарно-адресованных полинуклеотидов и испытание их антивирусного действия, является одним из направлений исследований, ведущихся в лаборатории генной инженерии вирусов животных ВНИИ СБ под руководством профессора, чл. корр. ВАСХНИЛ, Т.И. Тихоненко.
Цели и задачи исследования: Целью настоящей работы являлось сравнение ингибирующего действия созданного рибозимного гена, химически синтезированных олигодезоксинуклеотидов (олигоДН), и генов антисмысловых РНК (асРНК) к вирусу лейкоза коров (ВЛК) в клеточной культуре, хронически инфицированной ВЛК.
В процессе работы предстояло решить следующие задачи: ІІ. Создать генно-инженерную конструкцию несущую рибозимный ген под контролем вирусного промотора U3- области LTR-BLV, активируемого вирусными трансактиваторными белками и обеспечивающего эффективную экспрессию антивирусных генов в условиях ВЛК инфекции.
2. Синтезировать ряд немодифицированных
олигодезоксинуклеотидов (олигоДН) к функционально-активным
участкам R области генома ВЛК.
3. Получить клеточные линии, стабильно-трансфицировашше
генами асРНК и рибозима.
4. Провести сравнительный анализ ингибирующего действия
асРНК, олигоДН и рибозима в клеточных культурах, полупермиссивных
для вируса лейкоза коров и моделирующих хроническую вирусную
инфекцию в условиях in vitro.
5. Сравнить метод анализа вирусной репродукции в клеточной
лшши FLK-BLV-SEAP с общепринятыми методами оценки репродукции
ретровирусов по синцитийобразованию и активности обратной
транскриптазы.
Научная новизна и практическая значимость: В настоящей работе впервые показана возможность подавления хронической ВЛК инфекции в культуре клеток генами асРНК и рибозима под контролем собственного вирусного промотора U3 области LTR-BLV. Первая часть работы посвящена созданию рибозимной конструкции под контролем промотора LTR-BLV и синтезу олигодезоксинуклеотидов, комплементарных функционально-активным участкам R области генома ВЛК. Вторая часть работы является исследованием эффективности антивирусного действия асРНК, олигоДН и рибозима в линии клеток, хронически-инфицированной ВЛК. Оценка- уровня вирусной репродукции проводилась по различным параметрам: по уровню синтеза маркерного гена '(в данном случае' по синтезу щелочной фосфатази), чуствительного к вирусным трансактиваторным факторам BLV; по уровню вирусиндуцированного синцитийобразования при сокультивированш клеток-продуцентов ВЛК с клеточной линией СС8І; по уровню активности обратной транскриптазы. Максимальной иш лбирующей активностью в культуре, клеток обладали конструкции, содержащие ген асРНК к RU5 области генома ВЛК и рибозимный ген к R области области вирусного генома под контролем промотора U3 области LTR-BLV. Таким образом, показана возможность применения собственного вирусного , промотора ВЛК для эффективного подавления
хронической ВЛК инфекции в культуре клеток. Работа представляет не только научный, но и практический интерес так как дает возможность, применяя технологию получения трансгенных животных, получить линию с/х животных, устойчивых к заражеїшю вирусом бычьего лейкоза.
Апробация работы: Результаты работы были доложены и обсуждены на расширенном заседании отдела генной инженерии ВНИИ Сельскохозяйственной Биотехнологии и на I Евро-Азиатском Симпозиуме по современным достижениям в биотехнологии (Анкара, октябрь 1995).
Объем и структура диссертации: Диссертационная работа состоит из введения, глав "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты", "Обсуждение результатов", выводов и списка литературы, включающего 178 библиографических ссылок. Работа изложена на 114 машинописных, страницах включая 8 таблиц и 9 рисунков.