Введение к работе
Актуальность проблемы.
Изучение специфического взаимодействия транспортных РНК (тРНК) с аминоацил-тРНК - синтетазами (АРСазы) берет свое начало в 1950-е годы когда Ф. Крик постулировал суиествование адапторной РНК-молекулы, способной трансформировать информацию, содержащуюся в последовательности нуклеиновых кислот и переводить ее в аминокислотную последовательность белков. АРСазы (К.Ф. 6.1.1) обеспечивают специфическое присоединение аминокислоты к соответствующей тРНК и составляют самую многочисленную группу ферментов, участвующих в реализации генетической информации. При всем разнообразии первичных и пространственных структур АРСаз многочисленные эксперементальные данные подтверждают предположение о том, что сложный процесс узнавания можно представить как совокупность более простых взамодействий дискретных модулей тРНК и фермента, обеспечивающих специфичность и катализ (Buechter, D. k Schimniel, Р., 1993)с Эти модули ковалентно связаны в одной молекуле (тРНК, мономерные АРСазы) или входят в состав олигомера (АРСазы, обладающие олигомерной структурой). Несмотря на ' очевидную связь между центрами специфичности и катализа способ передачи информации о корректном связывании элементов узнавания в активный центр фермента остается малойзученным.
Рентгеноструктурный анализ комплексов тРНК-АРС показывет существенное изменение конформации фермента и субстрата при взаимодействии, что говорит о возможном сопряжении структурных перестроек компонентов комплекса и передачи сигнала между элементами специфичности и катализа (Moras, D., 1993). Для тРНК этот вопрос может быть сформулирован как роль фосфодиэфирного "остова", а так же способность молекулы подвергаться соответствующим конформационным изменениям. В АРС -взаиморасположение активного и узнающего центров и их связь с доменной или олигсмерной структурой фермента. Некоторым аспектам данной проблемы посвящена наша работа.
Фенилаланиновые тРНК и АРСазы (PheRS) относятся к наиболее изученным с точки зрения структуры к элементов узнавания tFHK. По наличию характеристических последовательностей PheRS принадлежат к второму классу AFCa3, но присоединяет аминокислоту к 2'-гидроксильной группе концевого аденозина, что характерно для АРСаз I класса. Цитоплазматические PheRS из всех описанных источников являются гетеротетрамергми с молекулярной массой около
250 kD и тем неожиданнее было открытие аминоацилирующей активности мономерной а-субъеденицы PheRS из митохондрий дрожжей (Sanni, A. et al, 1992). Изучение данного фермента представляет большой интерес с точки зрения эволюции олигомерной структуры и элементов узнавания тРНК.
При исследовании молекулярных основ узнавания тРНК основное внимание традиционно уделяют локализации функционально важных нуклеотидов, но практически неизученным остается вопрос о роли сахарофосфатного остова и, в частности, фосфодиэфирных связей в молекуле тРНК при взаимодействии с АРСазами. Вопрос о вкладе различных фосфодиэфирных связей в поддержание корректной трехмерной структуры частично исследован на примере кольцевой тРНКР1,е из дрожжей (Pan, Т. к Uhlenbeck, 0., 1991), но аналогичные данные для реакций аминоацилирования отсутствуют. В столь высокоорганизованной структуре как тРНК, очевидно, необходимо рассматривать не только функционально-важные фосфодиэфирные связи, но и роль отдельных элементов вторичной структуры и третичных взаимодействий. Цели и задачи работы.
Данная работа посвяшена. исследованию дрожжевой митохондриальной PheRS - одного из примеров изменения олигомерной структуры АРСаз в процессе эволюции, а также выяснению функциональной роли отдельных доменов и третичных взаимодействий в тРНК (дрожжевая "тРНКи'1) и ' кова'лентной непрерывности '"тРНК (дрожжевая тРНК"'1, тРИКТгр быка).
При этом ставили следующие задачи:
Получение методами белковой инженерии а-субъеденицы дрожжевой митохондриальной PheRS для анализа узнаваемых нуклеотидов в tPHK"" и определения положения первичного присоединения аминокислоты.
Разработка общего подхода для изучения роли различных . фосфодиэфирных связей тРНК в реакции аминоацилирования.
Идентификация функционально-важных фосфодиэфирных связей в различных тРНК (тРНК1гр быка и тРНК1"' из дрожжей).
Изучение роли третичных взаимодействий в акцепторной функции дрожжевой тРНКИе1 методом направленного мутагенеза.
Исследование субстратных свойств молекул РНК, моделирующих отдельные домены дрожжевой тРНК е и различные способы их организации.
Нз"чная новизна работы.
Впервые выделен из природного источника продукт гена MSF1. Показано, что: для эффективного аминоацилирования тРНКР>" необходимо наличие как 2", так и З'-гидроксилов концевого рибозного остатка; единственным элементом узнавания в тРНК является антикодон.
Разработан обший подход для идентификации функционально-важны;; фосфодиэфирных связей в, молекуле тРНК. Показано, что "набор" связей, ковалентная непрерывность которых необходима для - сохранения амноацилирующей активности исследованных тРНК (тРНКТгр быка и - дрожжевая тРНКМе'), индивидуален. Исследованы субстратные свойства тРНК -транскриптов с мутациями по положениям третичных взаимодействий. Установлено, что отсутствие отдельных третичных взаимодействий не влияет на аминоацилирующую активность тРНК,^ однако, замены, приводящие к компактизации трехмерной структуры, полностью блокируют реакцию.
С использованием,ряда модельных РНК-субстратов, полученных
на основе дрожжевой тРНК et, показано, что антикодон (основной
элемент узнавания в тРНК1"' для MetRS), отделенный от
акцепторного домена, не способен стимулировать реакцию
аминоацилирования. Установлено, что необходимым условием
протекания реакции являются контакты MetSS с D-шпилькой в
молекуле тРНК"". '
Апробация работы.
Материалы диссертации были представлены на следующих конференциях:
-
14-th International tRNA Workshop (1993) Cap d'Agde, France
-
Young Scientist's View of Molecular Biotechnology (1994) Ascona, Switzerland.
-
Molecular Biology on the Border of ХХІ Century. Moscow, 1994.
-
A World of RNA: Structure and Function (1994) Spetsai, Greece.
Структура диссертации.