Введение к работе
Актуальность работы. Химические методы борьбы с сорняками являются составной частью современной агропромьпшенности. Подсчитано, что наличие сорняков уменьшает урожайность по меньшей мере на 12%. В настоящее Ереыя в мире используют более 100 фатотокенческих материалов в заде коммерческих гербицидов. Только в США на эти пели ежегодно тратят пять мнллиардоз долларов.
Однахо, существуют экологические проблемы, тесно связаные с использованием гербицидов. Большинство гербицидов, используемых в сельском хозяйстве в качестве средств зашиты растении - хлор-, ртуть- и кшпыпходерхащке соединения, получаемые с помогдыо химического синтеза. Такзе соедгиекия, как прзвнло, с трудом рззлагаются после пряненення в сельском хозяйстве, накапливаются в почзе и растениях, что вызывает серьезные нарушения экологической с5стаяогки. В связи с этим возросла необходимость использования в качестве гербицидов таких соединенлй, которые после оказания воздействия исчезают го окружающей среды. Наиболее эффективно биодеградацта подвергаются гербицидн, являющееся штйзкоттамк.
Другая .проблема, связанная с жсиользованием гер5ипйДоз - это ограниченная селективность гербицндкого дгйсгвня или, вообще, отсутствие селективности. Гсрбютды, в оснозвэм, воздействуют на процессы, которые являются уникальными для растений, например, ка пути фотосинтеза или на пути биосинтеза незамеивных ашиюкислот. Tax как эти процессы часто совпадают у культурных ргсгашй и сорняков, то многие гербняиды являются неселективкыми.
Поскольку некоторые растекия обладают природной устойчивостью х гербетгдпам, то в результате скргиитчния н селекции это свойство может быть перекссеыко в родственные растенья. Так, путем скрешязакия культурных вядоз Siassic?. с дикими были иолучг.чы культурные растеши, устойчнвыг к трЕЗЗЕку. Анзлспрглым способом была получека соя, устойчивая к иетрабузкну. Но сгрвдивгншэ поддаются только близко родственные растения, а для игсколькта: гербжепщг вообще неебкорузекио природной устойчшостп в ргстспиях, поэтому приходится применять ноеьіє подходы.
Изучение прах-дней устойчивости, прогресс, датптгнугый в понимании механизноз Еоздейст^ия гербицидов и метода пенной нкжекрки растений открыли новые возможности для создания растений, устойчивых к гербицидам. В настоящее время существуют две нгнбояее раслосгралекные стратгтш сездгіпя тррксгекных растений, устойчивпх к гербицидам. Одна из
них предусматривает создание растений, которые будут синтезировать иягнбируехыв бегок в очень больших количествах, в поэтому определенное количество гербицида не сможет его ингибировать. Иди же можно эхепрессироватъ » растениях мутантный гея фермента, который i:c будет взаимодействовал, с гербицидом. Другой подход заключается в переносе в растения чужсрсйяого гені, продукт которого разлагает гербицид иди модифицирует сто в неакгизиую форму.
Оба упошпугых подхода были с успехом использованы для создания трансгенных растений, устойчивых к различным гербяпндам.
Одням из наиболее перспективных гербшшдов-аятЕбаотикоЕ тотального действия являютсвбигясфос. Бвзлофос - этотрЕПситид действующим началом которого «зляегся L-фосфшіотрншаі (РРТ). Данный гербицид примечателен тем, что быстро разлагается в почве н растениях, а также не оказывает вредного воздейспост на животных и людей.
Основной ыяыелыо L-фосфинотршшна в ргстггельгюй клетке является глутаминсинтаза Настоящая работа оосвятзела экспрессии в растениях табака в картофеля гена Ъзг, годируюпего фосфшісяршхішадеінпраясфсразу (PAT). PAT ацетилируег ЇРТ в адкпа-РРТ, н таким образом кнахгивирует гербитшд, поскольху гщеткл-PFT ие проявляет гербшшдного действия. "Цель и зэдии исследования. Цель настоящей работы состояла в получении п весягдэванни трансгенных растений табака (Nicotiana tabacum) SRI а картофеля (Soiaraun tuberosum) среднераннего сорта Прнгожий-2, устойчивых к тербїпиду РРТ. В задати исследования входило: модификация bar гена с целью повышения эффективности инипиагдаи трансляции в эукарнотах; создание кассеты экспрессии в растениях, с гетеролопгшым геном; 3- получение на основе решшиентного штамма LBA 4404 штамма перенос созданной кассеты и экспрессии модифицарованого гена Ваг в N.tahanim н S.tabeiogna; исследование устойчивости трансгенных растений к обработке РРТ; получение клубней трансгенного картофеля, пригодных для высадки в почву и дальнейшей сеяехнии. Научная новизна и практическая ценность. При помоши полимеразиои цепноп реакции GTG кодон инициации трансляции гена Ваг был заменен на ATG. Сконструирована кассета экспрессии в растениях bar-гена под контролем регуляториш элементов 35S РНК CaMV: даннгя кассета перенесена ii штамм Ajrobacterium tumefacierc; LBA 4404, используемый -для трансформации растений. Получены трансгенные растения N.tabacum и S.tuberosum (сорт Притохи8-2), эхспрсссируюшие bar ген. Показано, что эта растения устойчивы к обработке гербицидом РРТ. На траисгеяных растениях N.tabacum продемонстрирована устойчивость приобретенного признака в втором поколении. Получены клубни трансгенных растений S.tuberosum, пригодные для высадки в почву и дальнейшей селскшш. Предложен новый метод выделения генокной ДНК растений пригодной для ППР анализа. На основе ПЦР разработз:! метод отбора трансгеннда растений, одновременно позволяющий определить возможное заражение агробахгериями. Создана компьютерная программа, облегчающая подбор гграймеров ддя ПІІР-аналяза растений, регенерированных после трансформация. Полученные результаты открывают новые возможности для получения фосфинотришшустойчиЕых сортов сельскохозяйствевнш растений. Созданные рекомбинантные плазмиды и штаммы переданы в ряд других лабораторий Институтов РАН, где нашли применение в научно-исследовательской и практической работе. Апробация работы. Прсдставлешще в диссертации результаты были доложены и ебсуядекы на I Всесоюзном симпозиуме "Новпе методы биотехнологии растении" (Пушино, 1991), на II Российском симпозиуме "Новые методы биотехнологии растений" (Пушино, 1993), на конференции "Биология культивируемых клеток растений и биотехнология" (Алма-Ата 1993) и на заседаниях коллоквиума лаборатории генетической йнженерги Центра "Биоиккенсрия" и Ученого Согета КМБ РАН. Струтсгура и объем диссертации. Диссертация состоят из введения, обзора литературы, мгтеркзлез и методов, результатов и обсуждения, выводов, списка литературы. Матеріал излохен на 9 страницах машинописного текста, ьклкяэет 15 рисунков и библиографический список из 162 нгзкпшл. Исчользовглчме сокращения. РРТ- фосфпнотргшн, РАТ- і!еомиштфосфстра*;сфгрзза.
агробахгерий, несущего созданную кассету экспрессии, для трансформации
растение;
фосфинотркпЕияцетйлтргнсфераза, CaMV- вирус мозаяхл цветной капусты,
ПЦР- полкмеразная пе.чягя реакция, CS- глутамкіісагггстаза, NAA-
нафтялуксуенгя хислота, ВАР- S-бензіїлаіягооігуршг, NPT-