Введение к работе
Актуальность темы: Среди задач, которые приходигся решать при создгнии ценных сельскохозяйственных культур, наиболее важной является получение растений, устойчивых к. насекомым-вредителям. Особенно это актуально в отношении колорадского картофельного жука, потенциальные потери урожая от которого в отдельна регионах, могут достигать от 6.8 до 3S.5S в зависимости от сорта и фазы развития растений в момент появления вредоносной стада вредителя. Традиционные методы селекции устойчивых сортов трудоемки и дое" ;_иеменны, а применение инсектицидов зачастую, создает неблагоприятную экологическую обстановку не только в пределах агрофи-тоценозов, но и в отдаленных природных биоценозах.
Развитие и широкое применение методов генетической инженери и методов трансформации растительных клетс:; позволло получать трансгенные растения, экспрессирушие гетерологичнзс гены. ? литературе имеются многочисленные примеры создания траясгенни" рг с-тений, устойчивость которых к различЕНі: пасексмЕ^-зрзлитолям обусловлена экспрессией в них генов ^-эндотоксинов (cry-генов) из
Bacillus thuringiensis раЗЛИЧНЫХ ПОДВИДОВ (Dellannay at al.,J989; Perlak et al.,1990; Itoh et al. ,1933):" Инсектицидное ДЄЙСТВИЄ
белков, кодируемых этими генами, известно давно. Однако, попытки экспрсссировать cry-гены в трансгенЕых растениях осуществлены относительно недавно. Но они показали, что природные последовательности этих гонов имеют низкий уровень экспрессии в клетках трансгенных растений. Поскольку гены инсектицидных белзов имеют бактериальное происхождение, по-видимому, низкий уровень их экспрессии в трансгэнных растеЕИЯХ связан с различаем кодонового состава про- и syxapaoT. Поэтому возникла идеяо получении н экспрессии
синтетическк аналогов этих генов с кодоновым составом, оптимизированным для трансляционной системы растений.
. . Настояея работа посвящена изучению экспрессии в трансгенных растениях картофеля частично модифицированного гена з-эндотоксина
ИЗ Bacillus thuringiensis var. tenebrionis И ИССЛЄДОВаШЮ ИНСЄК-
тицидного деаствия его продукта.
Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в получении растений картофеля сортов Темп, Desiree, Resy, гранат экспрессирупшх частично модифицированный ген s-эндотоксина из
Bacillus thuringiensis var. tenebrionis И Изучений ВЛИЯНИЯ ЄГО
экспрессии на устойчивость трансгенных растений к повреждению колорадским хуком. В задачи исследования входило:
-
Замена исходных кодонов на оптимизированные для трансляции в растительных клетках.
-
Создание конструкций для экспрессии в растениях частично модифицированного гена s-эндотоксина, содеркащах регуляторные элементы, обеспечиващае эффективную экспрессию этого гена в растениях.
-
Получение На ОСНОВе реЦИПИеНТНЫХ ИТаШОВ LBA44Q4. А281,
CBE21 штаммов агробактерай, несущих созданные кассеты экспрессии, для трансформации -растений.
4. Трансформация растений картофеля (Solanum tuberosum L.) и
изучение экспрессии модифицированной последовательности в трансгенных растениях.
5. Исследование устойчивости трансгенных растений к повреж
дению колорадским жуком, получение клубней трансгенного картофе
ля, пригодных для дальнейших манипуляций.
Научная новизна и практическая ценность работы. С ПОМОЩЬЮ метода полимгразной цепной реакции проведена частичная модифика-
ЦЙЯ ПРИРОДНОЙ Последовательности Гена S-ЕНДОТОКСИНа КЗ Bacillus
thurin^iensis var. tenebrionis. Сконструирована кассета экспрессия этого г-ана под ксЕтролвм.регуляторних глементов 35S-PHK вируса мозаики цветной капусты. Полученная конструкция
Перенесена В ШТаМКЫ Aerobacterium tumefaciens ЦЗА4<04, А281,
сбезі, используемые для трансформации растений. Получены
ТраНСГёННЫе растения S.tuberosum СОРТОВ ТЄМП, Desiree. Resy,
Гранат экспрессируюзе частично модифицированный ген о-эндотоксина. Доказано, что эти растения оказкзают угнетающее воздействие на лабораторную популяцию колорадского зхука.
Известно, что многие сорта, обладсл целым спектром полезных и ценных качеств, в значительной степени поражаются колорадским куком. Поэтому тем Оолее ванной является задача придания таким сортам устойчивости к этому вредитега. Полученные клубни транс-генных растений могут сыть использованы как для дальнейших биологических испытаний, так и для вовлечения в селекционные работы.
Апробация работы. Представленные в диссертации результаты были Д0Л02ЄШІ а обсуяденн на її Мездународаом симпозиуме "Новые методы биотехнологии растений" (Пущино, 1993), на конференции "Генетическая инженерия и биотехнология" (Мине::, 19М), на.заседаниях коллоквиума лаборатории генетической инженерии и Ученого Совета Центра "Бкоинженерия" РАН.
Структура и объем диссертации. Диссертация ссстсят из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов и методов, изложение а сбсуздзвЕе экспериментальных результатов, выводов и списка литературы. Работа содержит 102 страницы машинописного текста, зклэтает 11 рисунков и бсолзографаческЕй список из 138 названий.