Введение к работе
Актуальность темы. В последнее время рекомбинантные антитела человека все чаще находят применение в терапии некоторых заболеваний. Одним из подходов к получению искусственных антител является конструирование одноцепочечных антител (scFv), представляющих собой вариабельные домены тяжелых и легких цепей, объединенных пептидным линкером в единую молекулу. Обладая небольшими размерами, одноцепочечные антитела легче проникают в ткани и вызывают меньший неспецифический иммунный ответ. Кроме того, одноцепочечные антитела быстрее выводятся из организма. На основе одноцепочечных антител могут быть сконструированы полноразмерные антитела человека путем объединения их вариабельных доменов с константными доменами иммуноглобулинов человека. Одним из способов получения одноцепочечных антител является их отбор из комбинаторных библиотек методом фагового дисплея. При этом ключевым этапом является конструирование комбинаторной фаговой библиотеки, которая представляет собой популяцию бактериофагов, каждый из которых экспонирует на своей поверхности уникальное миниантитело, и в ходе процедуры аффинной селекции с использованием целевого антигена можно отобрать фаговые антитела против этого антигена.
Фактор некроза опухоли (ФНО-а) является главным медиатором острого воспалительного ответа на грамотрицательные бактерии и другие инфекционные агенты. Основная роль его заключается в способности индуцировать провоспалительные медиаторы, такие как ИЛ-1, ИЛ-6, гранулоцитариый макрофагальный колониестимулирующий фактор, а также белки-хемоаттрактанты. Главным стимулятором запуска продукции ФНО макрофагами являются бактериальные липополисахариды, а основным источником ФНО-а в организме являются активированные мононуклеарные фагоциты.
При тяжелых инфекциях, ФНО-а, продуцируемый в большом количестве, может вызывать системные клинические и патологические проявления: индуцировать лихорадку, вызывать увеличение синтеза провоспалительных белков, а также вносить ощутимый вклад при развитии локальных воспалительных реакций. Пролонгированная продукция ФНО-а вызывает и метаболические повреждения, включая кахексию. Поэтому, факторы, блокирующие действие данного цитокина, являются многообещающими в терапии ряда патологий, включая вирусные гемморрагические лихорадки и аутоиммунные заболевания. К таким факторам можно отнести и специфические антитела к ФНО-а.. В настоящее время наиболее перспективными в медицине считаются человеческие моноклональные антитела. Однако получение антител человека с помощью традиционной гибридомной технологии не удовлетворяет требованиям, предъявляемым к медицинским препаратам, поэтому актуально получение рекомбинантных антител человека против ФНО-а.
Для получения рекомбинантных антител человека против ФНО-а, необходимо было на первом этапе сконструировать представительную комбинаторную фаговую библиотеку антител человека, а
БЛИОТЕКА _
НОС. НАЦИОНАЛЬНА» БИБЛИОТЕКА С! 08
затем отобрать из нее высокоспецифичные рекомбинантные антитела против ФНО-а. Следует отметить, что если сконструированная библиотека обладает большой представительностью, то такая библиотека может послужить источником практически неограниченного спектра антигенов.
Цель данной работы заключалась в конструировании неиммунной фаговой библиотеки одноцепочечных антител человека, отборе из полученной библиотеки антител к ФНО-а и изучении их иммунохимических свойств.
В соответствии с поставленной целью необходимо было решить следующие задачи:
сконструировать неиммунную комбинаторную библиотеку одноцепочечных антител человека на основе лимфоцитов периферической крови доноров и оценить размер и представительность полученной библиотеки; і
отобрать из полученной библиотеки фаговые антитела, специфически направленные к ФНО-а человека человека и исследовать их специфичность и хаактер связывания с этим антигеном ;
сконструировать штаммы Escherichia coli, продуцирующие одноцепочечные антитела человека против ФНО-а в растворимой форме;
получить очищенные одноцепочечные антитела человека против ФНО-а, подтвердить их специфичность и определить аффинность;
определить аминокислотные последовательности полученных одноцепочечных антител.
Научная новизна и практическая ценность работы. В настоящей работе впервые в нашей стране сконструирована нативная неиммунная фаговая библиотека одноцепочечных антител человека на основе лимфоцитов периферической крови здоровых доноров, представительность которой составила 2x10* независимых клонов. Проведенные эксперименты подтвердили возможность отбора из сконструированной библиотеки антител против различных антигенов.
Впервые были получены фаговые одноцепочечные антитела против ФНО-а человека и вирусоподобных частиц, образованных коровым белком вируса гепатита В; получены фаговые антитела против вируса осповакцины. В дальнейшем сконструированная библиотека может быть использована для отбора из нее одноцепочечных антител человека против широкого спектра антигенов.
В результате проделанной работы впервые были получены штаммы Escherichia coli, продуцирующие растворимые одноцепочечные антитела sAl и sB3 против ФНО-а, и оценена продуктивность этих штаммов. Получены очищенные одноцепочечные антитела sAl и sB3, показана специфичность взаимодействия этих антител с ФНО-а человека и определены их константы аффинности. Определены аминокислотные последовательности полученных антител. На основе полученных антител в дальнейшем могут быть сконструированы полноразмерные антитела человека, специфично взаимодействующие с ФНО-а.
Апробация работы и публикации. Материалы диссертации были представлены на Международной конференции «Human Antibodies and Hybridomas» (Берн, 2002), на XII Международном вирусологическом конгрессе (Париж, 2002), на Научной конференции «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (Новосибирск, 2002), на XVIII Международной конференции «Antiviral research», (Барселона, 2005), на Международном междисциплинарном симпозиуме «От экспериментальной биологии к превентивной и интегративной медицине», (Судак, Украина, 2005). По материалам диссертации опубликована одна статья, принята к печати, получено положительное решение о выдаче авторского свидетельства.
Объем я структура диссертации. Диссертация изложена на 126 страницах машинописного текста, включая 27 рисунков и 1 таблицу, и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы (130 наименований).