Введение к работе
Актуальность проблемны. Обнаружение каталитических свойств
у полирибоиуклеотидов принадлежит к числу наиоолее значительных событий в молекулярной биологии последнего десятилетия. Это открытие привело к пересмотру роли РНК в клетке и положило начало исследованиям каталитически активных РНК, получивших название рибозимов.
Помимо важного научного, эти исследования в перспективе имеют и практическое значение. Использование рибозимов в качестве эффективных и специфических ингибиторов экспрессии геноп клеточного и вирусного происхождения открывает путь к созданию новых средств терапии вирусных инфекций, опухолевых и иаследственныя заболеваний. В сельском хозяйстве возможно получение вирус-устойчивых растений и животных, а также растений ' и животных, у которых о помощью рибозимов блокируется фенотгашческое выражение нежелательных для человека генетических признаков.
По своему действию рнбознмы близки к аитисмысловым РНК. Однако, они способны не только образовывать комплекс о РНК-мишенью, но и расщеплять в ней определенную фоефодиэфирную связь. Сами каталитически активные молекулы не расходуются в процессе расщепления.
Дальнейшее широкое применение рибозимов для решения практических задач будет зависть от эффективности и стабильности экспрессии эндогенного РНК-катализатора, который должен быть
нетоксичен для клетки, от его способности функционировать в сложной внутриклеточной среде и доступности РНК-мишени.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлась разработка и изучение новых векторных систем для переноса и эффективной экспрессии в культуре эукариотических клеток генов рибознмоп, направленных против мРИК клеточных и вирусных генов.
В процессе работы предстояло решить следующие задачи:
-
Создать искусственные гены рибозимов типа "головка молотка", направленные против мРНК клеточных и вирусных генов: сскретир/емой плацентарной щелочной фосфатази (SEAP) и РВЛ субъединицы РПК-полимеразы вируса гриппа А.
-
Создать генно-инженерные конструкции, содерлеащие ген рибозима против мРНК SEAP в составе гена VA РНК аденовируса птиц CELO. Исследовать биолэгичсскую активность рибозима против мРНК SEAP в составе гена VA РШС аденовируса птиц CELO в бесклеточпой системе и в культуре клеток.
-
Получить дефектный рекомбинантный аденовирус на основе Atl5 человека, несущий ген рибозима против мРНК SEAP в составе CELO VA РНК в районе дслетированной Е1 области генома. Исследовать экспрессию гена рибозима и его биологическую активность при инфекции рскомбинантным вирусом культуры клеток.
Научная новизна и практическая значимость. В результате проведенной работы получена рекомбинантноя плазмила, несущая ген рибозима в составе гена VA РНК аденовируса птиц CELO. Показано,
что последовательности VA РНК CELO не оказывают негативного влияния на активность рибозима в бесклеточной системе, а вставка последовательности гена рибозима между промоторными боі:?ами гена VA РНК CELO не влияет на эффективтеть транскрипции гена VA РНК CELO в культуре клеток линии 293. Таким образом, впервые показана возможность использования гена VA РНК CELO для экспрессии рибозима в культуре клеток.
Впервые получен дефектный рекомбинантный аденовирус на основе Ad5, несущий ген рибозима против мРНК SEAP в составе CELO VA РНК в районе делетированной Е1 области генома. Показана экспрессия функционально-активного рибозима в клетках линии Неіл, инфицированных рекомбинантным аденовирусом, ингибирование транзиентной и стабильной экспрессии гена SEAP в клеточных культурах.
Впервые сконструирован искусственный ген рибозима против мРНК РВ1 субъединицы РНК-полимеразы вируса гриппа А. Рибозим был активен по отношению к модельному субстрату в бесклеточной системе.
Работа представляет не только научный, но и в перспективе может иметь и практический интерес, так как полученный функционально-активный в бесклеточной системе рибозим против мРНК РВІ субъединицы РНК-полимеразы вируса гриппа А может быть использован в дальнейшем для ингибирования репродукции вирусов гриппа сельскохозяйственных животных и птиц. Новые векторные
системы для переноса и экпрессии генов рибозимов могут быть применены для разработки средств противовирусной терапии и получения трансгенных сельскохозяйственных животных, устойчивых к вирусным инфекциям.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на семинарах лаборатории молекулярной диагностики и генной ни»: перин микроорганизмов ВНИИСВ, отдела генной инженерии ВІШІ1СБ, на международной конференции С1П "Technological Advances for in vivo Gone Therapy" (Вашингтон, ноябрь 1994 г.)
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 печатные работы.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 108 стр. машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования, их обсуждения, выводов и библиографического указателя, включающего i47 источников, из них 142 иностранных. Иллюстративный материал представлен 22 рисунками и одной таблицей.