Введение к работе
Актуальность проблемы
Гранулоцит колониостимулируэдий фактор человека (hG-CSF) - глпкопротеин с молекулярной массой около 19 кД, продуцируемый в незначительных количествах при соответствующей стимуляции макрофагами, фиСрсбластвми и клетками эндотелия, является вашим фактором кровзтворения. G-CS? человека характеризуется пироким спектром биологической активности, включая быстрее увеличение числа циркулирующих кейтрайїлькнх гранулоцитов in vivo и индукцию преимущественного образования колонки аейтро-филов. hG-CSF такз:э окззпвает влияние на активность зрелых гаитрэфнлов, переключая эти клетки на продукцию аниона супер-оксида в ответ на бактериальную инфекцию її усиливая антитело-завнекнуэ клеточпуп цитотоксичнес?ь и фагоцитоз. Кроме того, hG-CSF стимулирует тергсшалыше стадии дай^зрепцировки, по крайней нора, некоторых культквируекш: клэточных лилии человека. Сгшсапнко свойства hG-сзр открывают пфакке перспективы для его терапевтического прк.'.е-Еения пр-:і некотсрік видах рака с долыз преодоления нєйтреленни после трансплантации костного і'озга и интенсивной хиглгагерапип, а чг:с.з поваїения устойчивости к бактериальным ;г пируенш инфекциям, включая СГЩ.
По крайней мере, в одной ліспи клеток карциноми обкэрукэ-но налнчио двух ферм зрелого liG-CSP, включайте 177 (hG-CSPa) и 174 (hG-csPb) амшюинслотких остатка. Более длинная форма характеризуется наличием трех дополнительны! остатков после положения 35, начиная с н-конца. Образование двух форм молекулы hG-СЯї происходит при трзнеташл двух различных мРЖ, язля-нцихся продуктами альтернативного сплайсинга первичного тракс-іфішта.
S насте-язе граня провидится ряд исследований с даль» .детального изучения биологической активности hG-CSF, механизма рзгудянни экспресс:ги ого гена, кндпсцюї пролиферации и диффэ-ренцпровки хлеток-гпреднесгвэнннкоз, путей пэродачк сигнала после связпЕїшг.я :,'.олзкул hG-CSF клетсчжми рецепторами и т.п. G"другой, сторони,'в ходо клинических испытаний изучается терэ-павтіноскне возможности hG-csp (отдельно и в комбинации с другими цигокклгмя з: ;сгаіогорзп8Вїическ;жи агентами) при лечении иактериелына и вирусглк инфекции, а тскл:э некоторых калитки-гирушкх спухолзГг.
Вместе с тем остаются нерешэнныш вопросы функционального соотношения и значения двух форм белка, тканевой специфичности их продукции и распределения в тканях организма.
Указанные обстоятельства делают желательным получение двух форм hG-CSF в значительных количествах. Известно, что этот белок синтезируется различными тканями организма, однако в крайне низкой концентрации даже при максимальном уровне стимуляции, что сильно усложняет процесс его выделения и очистки. Лучшим источником получения природного hG-CSF' являются клеточные линии карцинош, для которых характерен конститутивный синтез белка. Однако использование методов генной инженерии позволяет достичь его суперпродукщш в бактериальных или зука-0ТИЧ8СКИХ клетках, причем показано, что рекомбинаятшй негли-козилированный белок полностью сохраняет свою биологическую активность.
Цель работы
Целью работы являлся химико-ферментагивный синтез двух форм искусственного гена, кодирующего два варианта гранулоцит колониэстлмулирущего фактора человека, и исследование их экспрессии в клетках Escherichia coll.
Научная новизна и практическая ценность работы
Настоящая работа является частью комплексных исследований по клонированию я экспрессии генов ростовых факторов и лимфо-кинов, проводимых в Институте Оиоорганической химии ИМ.М.М.Шемякина АН СССР. Ргбота проводилась в период с 1988 по 1991 гг в группе химии генов.
В результата проделанной работы с использованием химико-ферментативного штода получены две формы гена, кодирующего человеческий G-cs?, и изучена их экспрессия в бактериальных клетках. Сконструирована серия плазмидных Еекторов для зксп-рессии полученных генов, которые могут быть использованы для получения шгаммоз-продуцентов рекомбинангного hG-CSF.
Доступность двух форт белкового продукта гена hG-csp открывает возможность для получения антител и их использования в различных иммунологических исследованиях.
В настоящее время реномбинантный hG-csP успешно проходит широкие клинические испытания, которые свидетельствуют о чрезвычайной перспективности его использования при трансплантации костного мозга,а гаюке в терапии различных видов злокачествен-
шк опухолей, лейкемии, СГВДз, а также бактериальных и вирус-
ШІХ ШїфЗКЦИЯХ.
ООъеы работы
Диссертационная работа изломана на 103 стр машинописного текста к состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выеодоз и списка цитируемой ЛИТературк, СССТОЯЕЭГО ИЗ 143 ссылок.