Введение к работе
Актуальность проблемы. Одной из актуальных задач современной молекулярной биологии является выяснение механизмов взаимодействия- иммунной (ИС) и центральной нервной (ЦНС) систем организма. Важнейшую роль в этом взаимодействии играют пептидные гормоны -(опиоидные пептиды,, нейропептиды) и лимфокины (интерфероны,- ин-терле-Якины). Появляется все больше данных о том, что лимфокины, медиаторы ИС, оказывают непосредственное влияние на функции ЩС. И напротив, такие типичные медиаторы ЦНС, как опиоидные пептиды -в-эндорфин, динорфин, энкефалины - обладают иммуномодулирующими свойствами. Для понимания- природы взаимосвязи ИС и ЦНС необходимо изучить механизмы обмена сигналами между этими системами на уровне взаимодействия гормонов и лимфокинов с клеточными рецепторами.
В изучении этого взаимодействия на молекулярном уровне применяются различные, методы: исследование активности фрагментов гормонов и лимфокинов, полученных путем ферментативного расщепления или химического синтеза» направленный мутагенез, химическая модификация, конструирование гибридных молекул. В последнее время активно развиваются иммунохимические метода. Установлено, что некоторые моноклональные антитела к лимфокинам и гормонам ингибиру-ют их биологическую активность, тогда как другие не оказывают такого влияния. Локализация эпитопов для антител обоих типов имела бы большое значение для построения моделей структурно-функциональной организации гормонов и лимфокинов и моделей их взаимодействия с клеточными рецепторами. Однако определение таких эпитопов связано со значительными экспериментальными трудностями и может приводить к неоднозначным выводам при использовании разных методов. Альтернативным подходом для иммунохимического изучения структурно-функциональной организации молекул является использование антител, место связывания которых точно известно. Такив антитела могут быть получены путем иммунизации животных синтетическими пептидами - фрагментами нативных молекул.
Несмотря на принципиальную возможность получения антипептидных антител иммунизацией.животных свободными пептидами, обычно для. этой цели используют конъягаты пептидов с носителями, придающими им имиммуногенные свойства. В качестве таких носителей применяются белки, полиаминокислоты, некоторые В-клеточнка митсгенк и т.д. Для присоединения пептидов к носителям обычно используют
реагенты, способные реагировать с различными функциональным! группами аминокислотных остатков. Это приводит тс избыточной модификации аминокислотных остатков, не участвующих в фэрмкрованш ковалентних связей между пептидом и носителем, и к образованш сложной гетерогенной смеси полимеров. В результате искажается антигенная структура пептида и возникают нежелательные гаптеновы* группы с высокой иммуногенностью. Неадекватный мэтод синтеза пептидных конъюгатов может быть основной причиной отсутствия генерации антител желаемой специфичности, т. е. реагирующих как с пептидом, так и с нативной молекулой.
Цель работы заключалась в: (1) синтезе медиаторов ИС и ЦНС -опиоидшх пептидов данорфина и е-зндсрфина, а также фрагментої р.-эндорфяна и ГРИ-а2 человека, потенциально вовлеченных в формирование иммуномодуляторных центров; (іі) синтезе конъюгатов этап пептидов и получении антипептидных антител; (ііі) использованш полученных пептидов и антител для изучения иммуномодулируклфп свойств опиоидшх пептидов И 1М-в2.
Научная новизна и практическая ценность. Предложена HOBaj схема блочного синтеза пептидов, основанная на использовании ок-рзшенной 2-[4-(фенилазо)бензилсульфонил]атильной С-концевой защитной группы, облегчающей очистку синтезируемых пептидов. На основе предложенной схемы синтезированы опиоидныепептиды динорфин I е-зндорфин человека, фрагменты человеческого . лейкоцитарной интерферона а-2. Разработан новый эффективный способ синтеза бифункционального сшивающего реагента «-оксисукцинимидного эфир; з(2-пиридилдитио.)пропионовог кислоты (spdjp), образующего ковалентную связь между-є-аминогруппой.лизина-и сульфгидрильЕой : груши цистеина. Разработан эффективный способ синтеза пептидных конъюгатов с белками и' производными и-ацетилмурамилдипептида (ВДІ) "г пучены антипептидные антитела к фрагментам е-эндорфинэ ] а-ин.гтзферона, реагирукщие с целыми молекулами. С использование! синтезированных пептидов и полученных антител осуществлено функциональное картирована- е-ч*шэрфина и района 124-14* человеческого интерферона а2 .
Публикации и апробация работы. Но материалам диссертаци опубликовано 6 научных работ, Результаты работы докладывались н:
Всесоюзном симпозиуме по химии белков и пептидов в Ї987Г и на научных конфзрекциях ВНИИ МБ.
Объем работы и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 125 страницах машинописного текста (содержит 85 страниц основного текста), состоит из взедекия, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов, списка цитируемой литературы из 131 наименований , содержит 3 таблицы и 16 рисунков.