Синтез и исследование физико-химических свойств неканонических структур ДНК, содержащих параллельно ориентированные цепи Тимофеев, Эдуард Николаевич

Введение к работе

Актуальность прпйпгмы. В настоящее время известны тр» различные нсгэноиическис структуры ДНК, содержащие параллельно ориентированные цепи: параллельная ДНК, трех- и четырехиелочечиые комплексы (тринлексы и квадруллсксы соотвеговсиио). Если исследовательский интерес к параллельной ДНК является скорее теоретическим, то изучение четырех- и. особенно, трехнепочечных комплексов стимулируется как ::х биологической ролью, так и перспективами их использования в качестве генных регуляторов. Что касается триплексаа. содер:іал;нх где п:раллелыи>х одинаковые цепи (параллельные или регомбинактиые триплекси), то их участие в обмене цепей в ходе обшей генетической рехомбнняти делает ИХ объектами особого гнкмання исследователей.

Возможная биологическая значимость чсгырсхцспочсчных и анлтараллсльных трехаепочечішх комплексов ДНК, а такзе исключительно вагная биологическая роль параллельных триплексов определяют необходимость детального изучения ;тих объектов. В связи с вгим исследование структурных и физихо-химтеекпх свойств трех- н чешрехцепочечных комплексов приобретает первостепенное звзченг.:.

Цель раоУгп.т. В настоящей работе осушсствлсн скстез и фіеаго-хкмическое исследование олигокуклестшшх моделей комплексов трех различных типов,- каждая из которых содерязгт параллельно ориентированные односменные или комплементарные (в уотсои-хриховском смысле) цели. Ого чси«іехцепочсчнь:с комплексы, из олигопуклеотидоБ с чередующейся поетедоватслиюстью (GT)», внутримолекулярный триплекс Аіо-Тіо-Тю с АТТ страиванием оснований я внутримолекулярный триплекс рехомбипгмпюго типа со случайной последовательностью оснований. При исследовании этих моделей few использован синтсті:чсский подход, разработанный ранее для исследования другой необычной структуры ДКК - параллельной ДНК. Суть этого полхода, готовім мы назвали методом "принудительной ориентации цепей", заключается в том. что зтдельные куклеоткдные цепи связнвзттся мяиу собой по концам гибким гсссгчстиленовым кяи тризтилснглихольнси спейсором.

Научная новизне и прягнічягутм; чтпчт-»п«? P^T-l. В шсыяцей работе прегсгавленьї доказательства существования чеплрехпепочечиых гамплехсов с ггрлг.гхыю о,-!гсіітнроЕак:шми пенями т слкгоиуклсстидсв с "згредующимися остяками G и Т. Иссл^яовміьі фкзнЕО-хкшпгехне характеристик:! гігтипараллельмоіо триплекса с АТТ страиванием исногаинГі и вперши рзесчитакы

'І

термодинамические параметры образования триплекса в зависимости от концентрации NaCL В рабовс представлено исследование физико-химических характеристик синтетической «опели триплекса рскомбинактного типа (R форма ДНК) из короткого олигонуклеопт. образование которой нам впервые удалось осуществить без участия бслха RccA- Псвучсшшс дааные позволіип: дать количественную оценку преимуществ использованного синтетического подхода, а также впервые охарактеризовать R форму ДНК.

Anpnfiatnn работы. Материалы диссертации докладывались на международной конференции TEght Conversation in Biomolecular Stercodynamic", Albany, June 22-26. 1993.

Пубпшгвпла Пп теме диссертации опублиховано 5 статей и тезисы доклада.

Ргругтур» и ofiw.M pafinrn.i. Диссерташія состоит из введения, литературного обзора, обсухжаия результатов, экспериментальной части, кдюдов, списка литературы.

Работа одержит ^7 "^страниц машинописного текста, таблиц.

«?/Э рисунков. Бг&тография включастЛ?Л1аимснований.

Основные результаты работы.

1. Синят модельных олагонуклеотидов.

Метод "пршудитсльной ориаггации цепей*', использованный в данной работе для исследования фзшхо-химических характеристик комплексов с параллельными цепями, требует введаня в атшвігуклеотшшьій синтез как З'-димстокситрнтил-З'-фосфорамидии» иуклеомдов. так и 3'-димстохситрктил-5'-фосфорамидитов нуклеозидов, ясзеоляющих осуществлять наращивание цепей в направлении 5'-»3". Синтез №ашя-3'-дпмстокситрігпіл-5'-фосфорамидитов нуклеозидов проводился по следующей схеме:

_Racyl _H0_^ ry _Bacyl

^{K0V-My ,HOv^a}

3)Bu₄NF/THF

DMTr

2>r₂l

J""¹ CPrjN^POCH jCHjCN / Ten / MeCN

NccH,aijO

Для временной зашиты для 5'-гидроксила мы кспользагалн трст-бутилдимгтилхлорсилан, который избирательно и с высоким выходои силилируст первичную пцроксильную іруппу.

Синтез мономера, обеспечивающего введение гексашшольиого спейсора. был выполнен обычным образом исходя из 1,6-пжсандиола в две стадии: чрБтилировапие димстокситритилхлоридом в пиридине и фосфитилированис в аисгоніприле в присутствии тегразола.

Исследования олигонуклеотидлых моделей с гексамсгилс:;сгьг« спейсором выявили некоторые недостатки линкера на сенсве гсксаидисла. Во-первых из-за гидрофобного характера Cs углеводородного спейсора при повышенной концентрации соли набдхдается нежелательная ассоциация олкгонуЕгсотидов по гегегметмсновым фрагментам,' и,'' во-вторых, как показали " проведенные расчеты, длина гсхеамегиленового спейсора недостаточна. Необходимость увеличат длины и значительного повыш;ния гидрофильного характера иохкн привель нас к идее использовать триэтиленгяикольный фрагмент. Опггеэ соответствующего фосфорамидкта был выпаялся исходя из триэтиленгликоля аналогично синтезу фосфорамидита на основе гександиолг.

Как и ожигалось, нежелательной ассоциации олигонуглеотняшх шпилек, содержащих триэтиленглккольнын спейсор, мы ие наблюдали.

2. Исследования чгтирехцепочечних комллеххое ДНК.

С помощью ряда оптичесгих методов была исследована вторившая структура
олигоиукпеотидов 3'-<5(GT)spO(CK^60pd(GpT)s-3' (nap[d{GT)b и

y-d(GT)spO(.CilduOf (airra[d(GT)]).

\

Профили термической денатурации указывают на температурную область существования устойчивой вторичной структуры mp[d(GT)J и airra[d(GT)]: 0-10С Эти нижотешературиые комплексы способны связывать бромистый этидий, причем квантовый выход флуоресценции EtBr, интеркалированного во вторичную структуру nap[d(GT}J и auni[d(GT)]. приблизительно равен кваїповому выходу бромистого этики», связанного ~- тимусной ДНК.

Сравнение времся вращательной корреляции р для слигонуклеотндов nap[d(GD] и airm(d(CT)] с р для самокомплсментарнэго дуплекса CCGGATCCGG и исследованного ранее чстырсхцспочсчмого комплекса, образуемого олигонуклеопшом 3'-d(A)io рО(СНз)бОроХТ)і(г5', позволяет сделать вывод о том, что nap[d(GT)] и airrn[d(GT)] образуют квадруплексы в выбранных экспериментальных условиях.

Значения гидродинамического объема, вычисленные для исследованных олигоігуклеопикт исходя из модели цилиндра, подтверждают четырехцепочечную природу низкотемпературных комплексов nap[d(GT)] и aimi[d(GT)].

Сходство спектров КД nap[d(GT)] и aimt[d(GT)] при 3С указывает на структурное родство обоих комплексов. Для того, чтобы дифференцировать полностью параллельную и попарно антипараллепьную ориентацию цепей в исследуемых олигонукясотидах их спектры КД были сопоставлены со спектром КД полностью паршлельвой G4 ДНК из олигонуклеотида d(GtTtG«) и спектром попарно антипараллсльнон структуры, образуемой теломерной последовательностью - (TTAGGG)*. G4 ДНК-характеризуется увеличением положительной полосы при -260 им. С другой стороны шпилечный квадруплекс из теломера, содержащий две параллельные а две автипараллельиые цепи, обнаруживает положительный максимум при 293 ни. Увсдичсике КД полосы в 260 им и отсутствие эффекта Колена при 293 им однозначно указывает на параллельную ориентацию цепей в nap[d(GT)] и aimt[d(GT)]. Учитывая гибкость гексамстиленового линкера для квадруплекса на основе nap[d(GT)} могут быть предложены две возможные структуры (В и С).

^&Ш6>

С использованием димеризашш акридинового оранжевого на песпаренных нуклеотщах км определили долю нсспаренных нуелсотканых звеньев. Для исследованных шпилек она оказалась равной -50. Эта величина соответствует доле тнкипов и свивстсльствует, по видимому, о выпетливанни атих оснований, что подтверждается некоторыми литературными ліпший.

Исследование связывания бромистого зтидия с нкзхотезпературпыми структурами napfd(GT)] и aitre[d(GT)] обнаруживает кооператиггьш хграктср шггеркаляшш и необычно большое число мест свгзыванаЕ (по ьве молекулы красителя между соседними G4 плоскостями).

J. Исследоеские аитипараллелшого триплекса с АТТ страиванисл оснований.

В настоящем исследовании изучен олигонуклеотид 3'-(dA)io -рСКСШСНгОЬр-(dT)io-pO(CH2CH;0)₃p-(dT)io-5' [трі:пл(АТТ)], который вігугримолетупярно может образовывать тройную спираль. В дальнейшем такой внутримолекулярный триплекс мы будем называть "трехцепочечной скрепкой" (или просто "скрепкой"). Для сравнения были изучены также олигонуклеопиы 3'-(dA)io -рС(СН2СН;0)зр-(оТ)іо-5' [анти(ЛТ)] и 3'-(dA)io-pO(CH:CH20)3p-(dT)io-3' [пар(АТ)]. которые могут существовать в виде двухцепочечных шпилек с параллельной н анптараллельнэй ориентацией цепей.

' Приведенные ниже результаты получены при концентрации целей 10"⁴ М (2-]0 їлоль нуклсотиаоЕ-в литре). В этих условиях в рамках модели "вес или ничего* равновесие в растворе трипл(АТТ) можно описать схемой:

/\

D. Т

где Т, D и М соответствуют внутримолекулярной "скрепке", шпильке к разверігутой цепи.

На основе экспериментально измеренных профилей тепловой денатурации были рассчитаны термодинамические параметры всех трех переходов. Полугенные данные свидетельствуют о .том, что знтальпийные стабилизирующие взаимодействия приблизительно одинаковы в устсои-криковском dA-dT дуплексе и хугстиновском dA-dT дуплексе б составе триплекса.

При низких концентрациях Na* (0.01 и 0.11 М) и в отсутстше ионов Mg²* экспериментальные кривые плавления имеют четко выпаженныз двухфазный

і характер. Однако при более высокой концентрации Na* или г присутствии Mg¹* кривые выглядят внешне как однофазные. Причиной кажущейся однофззиосги является сближение температур плавления переходов M-D и М-Т и относительно малое ьзмснецкг поглощения при отшсплскии хугстиновсхой цепи. Повышение коїшсіпраиии Na* увеличивает стабильность шпильки и скрепки, но стабильность триплекса растет быстрее. Зависимость 7"_ш от lg[Na*] удовлетворительно описывается прямой линией с наклоном 11.5 (переход M-D), 14.8 (переход D-T) и 17JC (переход М-Т).

Если судять по величинам Т_т и АС, ионы мапшя в концентрации 0.01 М стабилизируют спиральные структуры приблизительно также, как и 0.51 М Na*. Однако, механизм стабилизирующего действия этих ионов принципиально различен. Ионы Mg²* усиливают экт&льпийные взаимодействия, вероятно, за счет образования специфических стабильных комплексов с двух- и, особенно, трехцепочечньат спиралями. Ионы Na* действуют в противоположном направлении, ослабляя энталытйные взаимодействия. Общее повышение стабильности шпильки и скрепки (понижение AG и увеличение; 7ш) определясгса энтропийным членом. Другими слова»!, увеличение концентрации Na* повышает хонформационную подвижность XZK дуплекса, так и триплехса. Полученные данные согласуются с представлением о нсспсцифическом дейстган ионов Na* ("ионная шуба").

Проведенное исследование позволило дать количественную оценку преимуществ трипл(АТТ) при изучении физико-химических свойств триплсксов по сравнению с системой из трех отдельных цепей.

Рассмотренные выше свойства трипл(АТТ) позволили корректно соотнести спектры КД со структурными компонентами равновесия. Некоторые особенности КД спектра исследованной схрепки позволяют предположить В-подобную конформаиию уотсон-криковсхого дуплекса в составе триплекса.

Связывание бромистого этидия с трипл(АТТ) свидетельствует о том, что триплекс из коротких олигоігуклеотидов способен связывать молекулы EtBr по антикооперативпому типу, как и ДНК. Кажущаяся константа связывания ЕШг с триплексом К=1ЛЛ(г М"¹ практически совпадает с константой, рассчитанной для ДНК (& IS-10* М'). Максимальное число мест связывания ЕШг на триплексе Омак^О-І) оказалось почти вдвое меньше, чей для ДНК (Гиис=0Л8). Таким образом. для посадки одной молекулы EtBr на триплекс требуется 9 нуклестидоа (или 3 тройки иуклеотидов). Это число не меняется при добавлении к фосфатному буферу 0.01 М ионов Mg²*.

Квантовый выход флуоресценции EtBr. сорбированного на триплексе в 0.01 М фосфатном буфере. рН 7. а 0.1 М NaCl оказала близким по величине к характеристикам ElBr в комплексе с тимусной ДНК при одних и тех же экспериментальных условиях.

4. Исследование триплекса рехомбинантиого топа (Я форма ДНК).

Триплекси рехомбинантного типа резко отличаются от триплехсов классического типа, описанных впервые Фсльзснфельдом. Если классические триплекси содержат в каждой цепи только пиримшшны или только пурины, причем одноименные кепи ориентированы гіггипараллельно, то в R-ДНК а каждой цепи присутствует полный набор нуклеиновых оснований и третья пепь ориентирована параллельно гомологичной цепи дуплекса. До настоящего времени параллельные триплекси (R-ДНК) были получены лишь при депротсишеации объединенных белком RccA трехцепочечных комплексов. Исследования свойств таких триплехсов ограничивались теоретическими расчетами конформации молекул, демонстрируя принципиальную возможность образования подобных структур.

В настоящей работе исследованы свойства параллельного триплекса из
олигонуклеотида 5'-d(CATGCTAACD-pO(ai2CH20)jp-d(AGTTAGCATG)

рО(СН2СНгО)зр-<1(САТССГААСТ)-3' (napARB). Гибкие триэтиленглихольные сеязки
обеспечивают для одноцепочечиого олигонуклеотида возможность складываться
дважды, образуя внутримолекулярный триплекс. Существует два способа - А" (в
главную бороздку уотсон-криковского дуплекса укладывается

З'-сегмент) и В (в главную бороздку уотссн-криковского дуплекса укладывается 5'-сегмепт) - укладки сегментов в триплекс. Полученные нами результаты однозначно указывают на то, что при низких температурах и рН 7 napARB образует относительно стабильный триплекс (Т_т находится в пределах от 26 до 34"С в зависимости от условий) с параллельно ориентированными идентичными цепями, причем конформер А превалирует в равновесной смеси.

Кривые плавления обладают ярко выраженным двухфазным характером и свидетельствуют об образовании в области низких температур многоцепочечных комплексов. Верхний температурный переход является кооперативным, как и следовало ожидать при плавлении дуплекса. Низкотемпературный переход характеризуется низкой кооперативн-эстью. Более того, та часть кривой плавления, которой соответствует область существования триплекса (за исключением плавления в присутствии спермидина), проявляет слабый двухфазный характер, указывающий на

многоступенчатое» перехода. Мерой стабильности низкотемпературных комплексов может служить эффективная температура плавления. Как моно-, так и двухвалентные катионы увеличивают стабильность триплексов. Ионы натрия не оказывают влияния на кооперативнесть первого перехода, тогда как двухвалеэтные катионы и, в сше большей степени, спермидин делают низкотемпературный псьіход более кооперативным. Кажущиеся значения Дй и AS, полученные из кривой плавлених триплекса в присутствии спсрмиднна составля'от длл низкотемпературного перехода Л Н=32-2±4 ккал/моль, АУ=104.6±12 кал/моль-К, а для высокотемпературного перехода ДН=49.9±4 гкал/моль, AS=l41.6±fi кал/моль-К. Таким образом, судя по формальним термодинамическим параметрам образования триплекса, сто стабильность ниже стабильности триплексов классического типа. Даїх с присутствии спермкдииа изменение энтальпии, сопровождающее образование триплекса, почти в 2 раза ниже соответствующего изменения энтальпии для уотсон-криковского дуплекса. Как было показано, при исследовании трппл(АТТ). переход от мгжмолекулярной модели к внутримолекулярной сопровождается повышением температуры плавления приблизительно на 30С Следовательно, межмолекулярный параллельный триплекс должен был бк иметь температуру плавления сколо 0С Это объясняет отрицательные результаты, полученные другими авторами при попытке зафиксировать образование межмолскулярпого R-триплекса.

Соотношение значений времени вращательной корреляции и гидродинамических объемов для napARB и дуплекса d(CCGGATCGGG)2. позволяющее оценить < относительную молекулярную массу триплекса составило при 3С 1.45, что однозначно указывает на образование трехиспочечного комплекса.

Реакция модификации тшшюб OsO< и ферментативное расщепление S1 нуклеазой nap(ARB) при 0-3С свидетельствуют о том, что все три цепи защищены от химической модификации и нуклеазного расщепления. Концевые основания во всех цепях подвергаются намного более сильной модификации по сравнению с центральными. Это свидетельствует, в свою очередь, об образовании внутримолекулярного трехцепочечного комплекса с экранированными пиримидиновыми основаниями и не содержащего одноцепечнія участков. Однако, 3'-коиасвой сегмент олигонуглеотида защищен в метшей степени по сравнению с двумя другими. Последнее обстоятельство дает основание полагать, что образование триплекса из олигоиуклеотида napARB протекает преимущественно по схеме' А. Обнаружено, что пиримшшиы легче подвергайте: выщепленшо, чем пурины, а

шгпшши легче, чем тимины. Экспериментально наблюдаемая стабильность триплетов описывается следующим рядом: G:O0 = А:Т-<Х » Т:А-Т > CG-C

Оптимизация геометрии структуры позволила предложить схемы водородного связывания для всех четырех триплетов оснований. Характерной особенностью водородного связывания в параллельном триплексе является то, что основания третьей цели связаны с основаниями обеих цепей уотсон-криковсхого дуплекса в каждом, триплете.