Введение к работе
Актуальность теыы диссертации. В последние годы особое внима-іе исследователей привлечено к ферментам протеолиза. Причиной та-)Го пристального внимания. является не только необходимость полу-іния фундаментальных знаний о природе взаимодействия белок-субст-iT, но и роль протеиназ, в частности эластаз, в развитии целого іда заболеваний человека: эластазы вовлечены в развитие эмфиземы !гких, хронического бронхита, панкреатитов и других заболеваний, связи с этим все большую актуальность' приобретает получение пре-іратов-ингибиторов протеиназ. Одним из потенциальных лекарствен-к средств, обладающих антапротемназной активностью, является эг-ш С - выделенный из пиявок Hirudo medicinalis высокоактивный и іеіЕфичшй ингибитор катепсина Q, панкреатической и лейкоцитарной іаетаз человека. Проведенное ранее изучение биологических и физи->-химических свойств зглива С показало не только его высокие ин-ібируюцке свойства и селективность действия, но и отсутствие ток-ганости в исследованиях на лабораторных животных^ Эглиз С прояв-іет высокую термо- и кислотостабштность, что язляется необходи-ш условием для применения препарата белковой природы в качестве яенциального терапевтического средства.
Все вышесказанное и предопределило задачу синтеза гена эг-ша С, конструирования экспрессионного вектора и получения штам-1-продуцента соответствующего белка.
Одной из областей применения синтетических олигодезоксири-)нуклеотидоз является создание зондов, используемых как в меди-шской диагностике, так и при проведении научных исследований в пекулярной биологии. Основное преимущество таких зондов, по )авнению с ДНК-зондами, заключается в возможности обнаружения то-;чных замен, что особенно важно при выявлении генетических забо-гваний. В качестве" репортерных в олигонуклеотидах могут выступать диоактивные или флуоресцентные соединения, красители, группы, гявляемые под действием ферментативных систем (биотин), ферменты іелочная фосфатаза, перокскдаза). Нерадиоактивно меченные олиго-гклеотиды обладают достаточно высокой чувствительностью в гибри-ізации, стабильностью и безопасностью в работе.
Как правило, введение репортерных групп осуществляли моди-ікацией гетероциклических оснований либо модификацией 3'- или -конца олигонукяеотида. Эти способы затрудняли использование инфицированных олигонуклеотидов для дальнейших ферментативных :акций in vitro. Все"это предопределило актуальность задачи соз-
дания принципиально новых нерадиоактивно меченных олигонуклеотид-ных зондов, модифицированных по межнуклеотидным фосфатным группам. Цель работы. Целью работы являлось: химический синтез гена ингибитора протеиназ зглин С, конструирование экспрессионного век- тора, получение штамма-продуцента соответствующего белка, отработка метода ввделения полипептида' и изучение его интибирующих' свойств по отношению к й-химотрипсину и эластазе. В задачу входила также разработка нового универсального способа"получения нерадиоактивно меченных олигонуклеотидных зондов.
Научная новизна. Предложены варианты метода сборки генов прямой амплификацией смеси синтетических олигонуклеотидов. Определены оптимальные параметры проведения такой сборки.- Создан высокоэффективный штам-продуцент эглина С. Предложена и отработана, новая схема получения аминоолигонуклеотидов и, на их основе, получены биотинилированные олигонуклеотидкые зонды. Показано, что синтезированные по данной схеме зонды могут быть использованы практически во всех ферментативных реакциях, применяемых в генной инженерии, а внесение модификации по межнуклеотидной фосфатной группе не приводит к существенному понижению температуры плавления комплекса оли-гонуклеотид-ДНК.
Практическая ценность работы. Разработана схема и оптимизированы условия сборки фрагментов ДНК прямой амплификацией смеси синтетические примеров. Практическая применимость схемы продемонстрирована на примерах сборки генов эглина С из пиявки и в-эн-дорфина человека. Получен штамм-продуцент и отработана схема выделения высокоэффективного ингибитора протеиназ - эглина С. Охарактеризовала ингиРирующая способность полученного полипептида.
Предложена новая схема получения нерадиоактивно меченных оли-годезоксирибонуклеотидов, позволяющая вводить любые репортерные группы в состав олигонуклеотида. Полученные по новой схеме олиго-нуклеотидные зонды могут быть использованы практически во всех ферментативных реакциях, применяемых в генной инженерии.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения собственных результатов и их обсуждения, еыводов и списка цитируемой аитературы (І44 ссылки). Обьем диссертации составляет 148 страниц основного текста, включает 41 рисунок и 3 таблицы.